检测庆大霉素药物的酶联免疫试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了一种检测庆大霉素的酶联免疫试剂盒，它含有：包被有包被原的酶标板，酶标记物，庆大霉素特异性抗体（当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时含有），庆大霉素标准品溶液，底物显色液，终止液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液。本发明专利技术还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测庆大霉素的方法，它包括步骤：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明专利技术提供的是检测动物源性食品中如鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝、奶粉、鸡蛋和饲料等样品中庆大霉素的残留量的酶联免疫试剂盒，其检测方法操作简便、费用低廉、灵敏度高，能够进行现场监控且适合大量样本筛查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫学检测领域，具体地说，涉及一种检测动物源性食品中如鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝、奶粉、鸡蛋和饲料庆大霉素类药物的酶联免疫试剂盒及其检测方法。
技术介绍
庆大霉素(Gentamicin)是氨基糖甙类抗生素，被广范应用于动物疾病的治疗，由于其具有神经毒性和肾脏毒性，在动物食品中的残留会影响人类健康，欧美国家及我国均要求其限量使用。检测庆大霉素残留量的化学方法目前有高效液相色谱法，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题本专利技术的目的是提供一种操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本筛查的方法用于检测鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝、奶粉、鸡蛋和饲料中庆大霉素药物的残留量。本检测试剂盒的主要内容物采用了方便使用的工作液形式，工作液保存性及稳定性好，克服了大多数本领域产品的技术问题；本试剂盒采用的检测方法提供了多种样本的回收方法，可用于多种样本的检测。(二)技术方案本专利技术的检测原理为当在酶标板微孔条上预包被庆大霉素偶联包被抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入庆大霉素特异性抗体溶液，样本中残留的庆大霉素或庆大霉素标准品与酶标板上包被的庆大霉素偶联抗原竞争庆大霉素特异性抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光值与样本中庆大霉素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中庆大霉素的残留量。同时也可根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度庆大霉素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中庆大霉素残留量的浓度范围。当在微孔条上预包被庆大霉素特异性抗体时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记庆大霉素抗原溶液，样本中残留的庆大霉素或庆大霉素标准品与酶标记抗原竞争包被在酶标板上的庆大霉素特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与庆大霉素药物的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中庆大霉素的残留量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，与系列浓度的庆大霉素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中庆大霉素残留量的浓度范围。当在微孔条上预包被庆大霉素偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记庆大霉素特异性抗体溶液，样本中残留的庆大霉素或庆大霉素标准品与酶标板上包被的庆大霉素抗原竞争庆大霉素特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与样本中庆大霉素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中庆大霉素的残留量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，与系列浓度庆大霉素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中庆大霉素残留量的浓度范围。当在微孔条上预包被抗抗体时，加入庆大霉素抗体孵育后，加入样本溶液或标准品溶液，再加入酶标记庆大霉素抗原溶液，样本中残留的庆大霉素或庆大霉素标准品与酶标记庆大霉素抗原竞争庆大霉素特异性抗体，用显色液显色，样本吸光度值与样本中庆大霉素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中庆大霉素的残留量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，与系列浓度庆大霉素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中庆大霉素残留量的浓度范围。本专利技术提供了一种用于检测庆大霉素物的酶联免疫试剂盒，它含有(1)包被有包被原的酶标板(酶标板上包被抗原，酶标记物为酶标记抗抗体时或酶标板上包被的抗抗体，酶标记物为酶标记抗原)；(2)酶标记物(可为酶标记抗原、酶标记抗体或酶标记抗抗体)；(3)庆大霉素特异性抗体工作液(酶标板上包被抗原，酶标记物为酶标记抗抗体时或酶标板上包被的抗抗体，酶标记物为酶标记抗原)；(4)庆大霉素标准品溶液；(5)底物显色液；(6)终止液；(7)浓缩洗涤液；(8)浓缩复溶液。本专利技术所提供的检测庆大霉素的酶联免疫试剂盒，包括包被有包被原的酶标板、可能含有庆大霉素特异性抗体工作液(酶标板上包被抗原，酶标记物为酶标记抗抗体时或酶标板上包被的抗抗体，酶标记物为酶标记抗原)和酶标记物工作液；所述包被原可为庆大霉素偶联抗原、庆大霉素特异性抗体或抗抗体；所述酶标记物为酶标记的抗抗体、庆大霉素抗原或庆大霉素特异性抗体；所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记的羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的，辣根过氧化物酶可采用现有技术中的多种方法将其与抗抗体进行偶联，如戊二醛法，过碘酸钠法等，本专利技术经过长期的劳动创造将过碘酸钠法进行了改良，使其省时、降低辣根过氧化物酶(HRP)与抗抗体的浓度比率，节省了原材料。所述庆大霉素特异性抗体可为庆大霉素单克隆抗体或庆大霉素多克隆抗体；它们均是用庆大霉素与载体蛋白采用戊二醛法得到的偶联物作为免疫原得到的；所述庆大霉素多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，所述庆大霉素单克隆抗体优选为庆大霉素鼠单克隆抗体，所述庆大霉素多克隆抗体优选为庆大霉素兔多克隆抗体。以上抗体均可以用庆大霉素与载体蛋白的偶联物作为免疫原按戊二醛法制备。所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白(BCG)、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白等常用载体蛋白；所述庆大霉素与载体蛋白的偶联物可通过将庆大霉素和载体蛋白用戊二醛法进行偶联得到。为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括庆大霉素标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。所述浓缩洗涤液为0.01M，pH7.4，含有0.8％～1.2％吐温20和0.5‰叠氮钠防腐剂的磷酸盐缓冲液。所述浓缩复溶液为0.01～0.05mol/L、含有0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。所述当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L硫酸；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显色液为对硝基苯磷酸酯缓冲液，终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。当酶标板上包被抗原，酶标记物为酶标记抗抗体时或酶标板上包被的抗抗体。其中酶标板在制备过程中所用的包被缓冲液为pH6.8 0.01～0.05mol/L的柠檬酸缓冲液；所用的封闭液含有5％马血清，0.1‰叠氮化钠，2.5％酪蛋白的磷酸盐缓冲液。本专利技术中酶标板的制备过程为用包被缓冲液将包被原稀释成0.05-0.1μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h，再4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200μl封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。本专利技术中抗原的合成过程为1.庆大霉素免疫原的制备将庆大霉素与载体蛋白采用戊二醛法进行偶联得到免疫原。庆大霉素是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。2.庆大霉素鼠单克隆抗体的制备动物免疫程序采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以庆大霉素与载体蛋白偶联物为免疫原，得到较好的多克隆抗体，取出肝脏进行细胞融合。细胞融合与克隆化取免疫BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选细胞株，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3.庆大霉素兔多克隆抗体的制备采用新西兰大白兔作为免疫动物，以庆大霉素与载体蛋白偶联物为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，多本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测庆大霉素药物的酶联免疫试剂盒，其特征在于它含有：　　　　（１）包被有包被原的酶标板；　　　　（２）酶标记物；　　　　（３）庆大霉素特异性抗体；　　　　（４）庆大霉素标准品溶液；　　　　　（５）底物显色液；　　　　（６）终止液；　　　　（７）浓缩洗涤液；　　　　（８）浓缩复溶液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何方洋，万宇平，冯才伟，吴小平，郭勇，朱亮，赵正苗，汪善良，冯才茂，刘平，陈炜琳，刘福林，冯月君，余厚美，蒲小容，罗贵昆，刘玉梅，
申请(专利权)人：北京望尔康泰生物技术有限公司，北京望尔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]