细胞内精氨酸酶检测方法技术

本发明专利技术公开一种细胞内精氨酸酶检测方法，该方法采用直接检测外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中精氨酸酶含量，其在结直肠癌中阳性检出率达７６．８％，检测细胞来源丰富，实验稳定性高，重复性好，节省试剂和耗材，可成为癌症患者早期诊断、预测复发转移和判断预后的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种医学检测方法，具体地说，涉及一种，属于医学检验领域。
技术介绍
近年研究发现精氨酸酶(ARG)是肝脏中的一种水解酶，它是三聚体结构，在鸟氨酸循环的最后过程中起催化作用最终形成尿素和鸟氨酸，这种酶已经在哺乳动物的组织中被发现，它能和鸟氨酸一样供给细胞，预防生物合成聚胺、并在细胞增生和分化过程中起重要调节作用，有诱导分化癌细胞作用。近年发现在患肿瘤和肝病病人的血清中，此酶活性都较高(Aminlari，MClin Biochem 199225.431-436)。因此国内外学者均对精氨酸酶能否在癌症患者组织中和血液中准确稳定的检出感兴趣，并进行了以下尝试血清中检测结直肠癌患者ARG，血清中检测乳腺癌患者ARG，新鲜结直肠癌组织中ARG等。但是各家报道的阳性率有很大差异，例如1998年2期湖北医科大学学报石俊等报道，乳癌病人血清中ARG的阳性率可达90％(18/20)；2002年日本学者PorembskaZ等报道(PorembskaZ等 CANCER June1，2002/volume94/Number11)，乳癌病人血清中ARG的阳性率可达63％，乳癌病人新鲜组织中ARG的阳性率可达74％；在结直肠癌患者血清中ARG阳性率可达88.9％，新鲜组织中ARG的阳性率可达92.5％。目前有2种经典的方法检测血清中ARG，即鸟氨酸法(Chinard FP.Photometric estimation of praline and ornithine.J Biol Chem.1952；19991-95)和尿素法(Jergovie I et al.A simple method for serum arginase determination.Chim Acta，1970；30765)。具体如下1.鸟氨酸法取病人末梢血2ml，离心，吸取上清备用。取0.5ml巴比妥钠，0.1ml L-精氨酸，0.1mlMncl2，0.5ml血清，混合； 37℃30分钟；加入1.3ml三氯醋酸终止，沸水煮1分钟，冷却；离心去除沉淀，留取上清；分别从实验管和对照管取出2ml上清液加入试管中；每个试管分别加入2ml冰醋酸和1ml茚三酮溶液；在沸水煮10分钟，冷却1小时，在515nm比色，测定ARG活性。2.尿素法取病人末梢血4ml，离心，吸取上清备用。为了除去血清中尿素的干扰，待测血清需预先透析处理。备用血清装透析袋透析12小时以上。透析后血清1ml，缓冲液1ml，活化剂0.3ml混匀，37℃60分钟，加入底物1ml；37℃120分钟，加入三氯醋酸0.2ml；离心10分钟去除沉淀，留取上清；加入上清液1ml，着色剂4ml混匀，5分钟后440nm比色，测定ARG活性。试剂配制同文献A simple method for serum arginase determination(ChimActa，1970；30765)，可以看出此法血清要前期处理，血清用量很大，所用试剂种类比鸟氨酸法多2种，实验时间长，这种方法不包括血清前期处理的时间，还需用200分钟左右才能完成实验。目前，所采用的精氨酸酶测定方法还有如下缺点(1)血清中有尿素的干扰血液的组成由血球、血浆两大部分组成，血浆包括水、血浆蛋白、葡萄糖、无机盐和含氮废物(尿素就在其中)。血液中尿素的浓度高低受多种因素影响，分生理性因素和病理性因素；病理性因素太多，只分析生理性因素高蛋白饮食就能引起血清尿素浓度和尿液排出量显著升高；而且男女水平也有差异，男性比女性高2--3mg/dl；随着年龄的增加有增高的倾向，成人的日间生理变动平均为3.8mg/dl。尿素是如何生成的，那就是著名的鸟氨酸循环精氨酸酶能催化精氨酸将其水解成为尿素和鸟氨酸。由3个阶段构成一个循环，即鸟氨酸----瓜氨酸------精氨酸。他们在体内循环往复。可以看出在血清中检测精氨酸酶影响因素很多，其中尿素的影响因素最大，生理性因素就已经使得精氨酸酶检测难以标准化，病理性因素影响就更多了。所以实验结果可以出现重复性试验不稳定、正常对照组精氨酸酶数值范围较大、很难摸索出正常值范围(国外有一位学者就采用患者自己与自己比较的方法来弥补没有正常值范围的问题)、正常人与病人精氨酸酶数值没有明显差异等一系列问题。有的实验人员采取透析法去除血清中尿素的影响，但是没有统一的检测方法证实血清中尿素是否除净；他们还忽略了生理性因素的影响，如果一位患者今天多吃了高蛋白饮食，明天又没吃高蛋白饮食，血清中尿素的含量会相差很大，用同样的时间和方法去除尿素是不科学的。以上是以一位患者举例，如果是多位患者就更无法统一了，所以血清中尿素的干扰，是血清中检测精氨酸酶的最大缺点。(2)血清用量太大血清中检测精氨酸酶需要1毫升的血清，病人抽血至少3-4毫升，血清量少就会影响检测结果。如果采取透析法去除血清中尿素的影响需要的血清量还要大。因为血清的用量大，相应其他试剂用量也大，造成了试剂和耗材的浪费。精氨酸酶主要存在于肝脏中，但近几年发现同时它还存在于细胞更新、生长迅速的组织细胞中；科学家们2004年最新研究发现，健康人肺部组织中没有精氨酸酶，但气喘患者肺部组织中却存在相当数量的这种酶。研究还显示，精氨酸酶在气喘发病中似乎起着主导作用，它会引发连锁反应，最终导致各种气喘症状出现。淋巴细胞是众所周知的免疫细胞，在这群细胞当中是否存在精氨酸酶呢？经过本专利技术研究人员近几年大量实验研究发现健康人淋巴细胞中精氨酸酶含量很低，但在许多种癌症患者淋巴细胞中却存在相当数量的这种酶。因此，如何准确稳定地在癌症患者的病变组织或血液中对精氨酸酶进行检测，对于癌症患者早期诊断、预测复发转移和判断预后有着极其重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的，该方法采用直接检测外周血单个核细胞(PBMC)中精氨酸酶，细胞来源丰富，实验稳定性高，重复性好，节省试剂和耗材，可成为癌症患者早期诊断、预测复发转移和判断预后的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案一种，包括如下步骤1)取人体末梢静脉血2～4ml抗凝处理，然后加入等体积的淋巴细胞分离液离心提取淋巴细胞层，细胞浓度控制在7×105～1×106个/ml，再加入100ul～500ul的裂解液，制成细胞悬液备用；2)然后对细胞悬液进行酶活化处理，并离心取上清液；3)最后对上清液进行显色处理及比色测定鸟氨酸含量。其中，所述抗凝可采用肝素、枸橼酸钠或EDTA盐等抗凝剂进行处理，比如所述肝素抗凝法为先将肝素配成50u/ml浓度，再取50ul-100ul的肝素对血进行处理。枸橼酸钠法常用浓度为配成109mmol/L，试剂与血比例为1∶9。EDTA.Na2抗凝方法处理为先配成15mg/ml，取200ul～300ul，对血进行处理。所述淋巴细胞分离液采用本领域常用的淋巴细胞分离液，用于分离人血液中的单个核细胞，比如天津市川页生化制品有限公司、Cedarlane公司Lympholyte淋巴细胞分离液，上海试剂厂的淋巴细胞分离液LymphocyteSeparation Medium(比重1.077)等。所述裂解液可采用TritonX-100，其主要成分为聚乙二醇辛基苯基醚，主要作用是细胞破膜去污剂/细胞通透剂，即在细胞膜上打孔，起到溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞内精氨酸酶检测方法，其特征在于，包括如下步骤：１）取人体末梢静脉血２～４ｍｌ抗凝处理，然后加入等体积的淋巴细胞分离液离心提取淋巴细胞层，细胞浓度控制在７×１０↑［５］～１×１０↑［６］个／ｍｌ，再加入１００ｕｌ～５００ｕｌ的裂解液，制成细胞悬液备用；２）然后对细胞悬液进行酶活化处理，并离心取上清液；３）最后对上清液进行显色处理及比色测定鸟氨酸含量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李世拥，安萍，徐一石，
申请(专利权)人：安萍，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]