本发明专利技术涉及一种利用酶扩增法、酶比色法及酶联法技术的离子钙诊断／测定试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定离子钙浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ氧化酶、ＮＡＤＨ过氧化物酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度下降的速度，从而测算出离子钙的浓度大小。采用本发明专利技术完全可以通过紫外／可见光分析仪器得出所需的测定结果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种离子钙诊断/测定试剂盒，同时本专利技术还涉及测定 离子钙浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定
技术介绍
血液中的钙几乎全部存在于血浆中，血浆钙有两种形式l非扩散 性钙，也称结合钙。它同蛋白质结合，不能透过毛细血管壁，不具有生 理活性，约占钙的40%; 2可扩散性钙，包括离子化钙，约占总f丐的 46%，是具有生理活性的部分。与碳酸氢根、磷酸盐、柠檬酸、乳酸等 阴离子结合的钙，约占总钙的14%。非扩散性钙与扩散性钙可以互相 转变并保持动态平衡。钙的生理功能主要为1构成骨骼和牙齿，维持和修补骨骼的完整性；2保持神经肌肉的正常应激性；3传导神经冲动；4维持细胞的正常生理通透性；5参与血疑过程；6激活某些酶的活性，如琥珀酸脱氢酶、ATP酶等；7对心肌收縮的影响，ca2+有利于心肌收縮，它和有利于 心肌舒张的K+相拮抗，从而维持心肌正常的收縮与舒张。血转与骨骼中的钙保持动态平衡。血钙含量的变化常能反映出骨组织的代谢情况，因 此测定血钙对某些疾病的诊断有帮助。总钙的测定方法很多，概括起来有滴定法(氧化还原滴定法、络合滴 定法)，比色法(方法很多，最常用又便与自动化操作的是邻甲酚酞合络酮法、甲基麝香草酚蓝法、偶氮胂in法等)，火焰光度法、原子吸收分光光度法、同位素稀释质谱法、酶法。国际临床化学联合(IFCC)推 荐的钙测定决定性方法为同位素稀释质谱法(IDMS)，参考方法为原子 吸收分光光度法。世界卫生组织(WHO)推荐的中等实验室用的常规方法 为邻甲酚酞络合酮法(O-CPC)。离子钙的测定方法大致有生物学法、透析法、超滤法、金属指示 剂法、离子选择性电极法.目前应用最多的是离子选择性电极法(ISE)。 此方法简便、迅速、重复性好，正确和敏感性高。测定结果不受血浆 蛋白质的影响，能反映机体钙代谢的实际情况。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶扩增法(Enzymatic doubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶) 联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶) 在340nm波长处吸光度的变化，得以测定离子钙浓度的方法，同时， 本专利技术还将给出用以实现该方法的离子钙诊断/测定试剂盒，采用该试 剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行离子 钙浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广 应用。本专利技术离子钙浓度测定方法原理如下还原型辅酶+氧NAD(P)H氧化酶/(>2+辅酶+过氧化氢 过氧化氢+还原型辅酶NADH过氧化物酶辅酶+ 2水这种方法应用NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase ; EC 1.6.3.l)需要钙离子才能激活酶活性的酶促反应速率比色法，加上利用NADH过 氧化物酶(NADH peroxidase ; EC 1.11.U ; EC 1.11.1.2)的加倍扩增作 用，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在 340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度 下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算离子钙 浓度的大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术离子钙诊断/ 测定试剂盒较为理想缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/LNAD(P)H氧化酶 12000 U/LNADH过氧化物酶 16000 U/L本专利技术的离子钙诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、NAD(P)H氧化酶、NADH过氧化物酶。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。试剂2缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶、NADH过氧化物酶。 还原型辅酶、NAD(P)H氧化酶、NADH过氧化物酶在试剂1或试 剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解 后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。 试剂2缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、NADH过氧化物酶。还原型辅酶、NAD(P)H氧化酶、NADH过氧化物酶在试剂1、试 剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前 加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定离子钙浓度的方法，其还 原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一本实施例的离子钙诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 还原型辅酶50 mmol/L0.25 mmol/LNAD(P)H氣化酶 12000 .NADH过氧化物酶 16000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37i:，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测离子 钙样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延 迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出离子钙 的浓度大小。 实施例二本实施例的离子钙诊断/测定试剂为双试剂，包括试剂1(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂 还原型辅f100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂50 mmol/LNAD(P)H氧化酶 10000 U/LNADH过氧化物酶 12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测离子 钙样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下 降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出离子钙 的浓度大小。 实施例三本实施例的离子钙诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L稳定剂 还原型辅酶50 mmol/L0.25 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmd/L稳定剂NAD(P)H氣化酶 试剂350 mmol/L 16000 U/L三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L稳定剂 50 mmol/LNADH过氣化物酶 20000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用酶扩增法、酶比色法及酶联法技术的离子钙浓度测定方法，其方法原理如下： 还原型辅酶＋氧 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ氧化酶／Ｃａ↑［２＋］辅酶＋过氧化氢 过氧化氢＋还原型辅酶 ＮＡＤＨ过氧化物酶 辅酶＋２水 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度下降的速度，测算出离子钙的浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。