本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的铜诊断／测定试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定铜浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、赖氨酸、赖氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在４００－７００ｎｍ波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出铜浓度的大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种铜诊断/测定试剂盒，同时本专利技术还涉及测定铜浓 度的方法，属于医学/食品/环境检验测定
技术介绍
正常成人体内含铜量为80~150mg,血循环铜占总铜量的10%。血 浆中约95。/。铜a2球蛋白牢固结合，称为铜蓝蛋白(Ceruloplasmin)，经 酸处理后才能与铜试剂反应。其余5%为游离铜。许多酶都含有铜，如 细胞色素氧化酶、超氧化物岐化酶、尿酸氧化酶、赖氨酸氧化酶、酪 氨酸酶、多巴胺3-羟化酶等。与白蛋白疏松结合的铜是运输、吸收、 排泄的重要形式和中间环节，也是合成各种细胞蛋白的原料。其它铜 蛋白还有血铜蛋白、肝蛋白和脑铜蛋白。铜参与造血过程，主要影响 铁的吸收、运送和利用。生物体液与组织中铜的测定方法包括分光光度法，火焰和无火焰原 子吸收分光光度法、发射光谱法、中子活化分析法和阳极溶出伏安法 等。铜的分光光度法都是利用铜形成有色络合物。火焰原子吸收法利 用铜离子在火焰中被还原为OA从铜空心阴极灯发出的光波Ci^吸收 的量与浓度成正比，用于血清、尿、组织中铜的测定。阳极溶出伏安 法是将铜离子作为汞齐被镀于阳极上，电压变得更正，使Cu从阳极"剥下"或再次溶解，形成的电流与Cu的浓度成正比，广泛应用于环境分 析。中子活化分析是利用中子将"Cu转变成不稳定"Cu同位素，后者 衰变时释放Y射线可在1。 34MeV计数，应用于特定研究中心。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶 联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)所导致在400"700nm波长处吸光度的上升，得以测定铜浓度的 方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的铜诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行 铜浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到 切实的推广应用。本专利技术铜浓度测定方法原理如下赖氨酸+氧+水赖氨酸氧化酶/012+ 6-氨基-2-氧代己酸+氨+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水这种方法应用需要铜激活的赖氨酸氧化酶(lysine oxidase; EC 1.4,3.13; EC 1.4.3.14)(偶)联过氧化物酶(peroxidase ; EC 1.11.1.7)酶促反应速率比色法。赖氨酸氧化酶酶解赖氨酸反应产生过氧化氢， 最后生成的过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将无色的还原型色原体 组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400_700nm (根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料 一吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye) —含 量高低的光吸收大小；通过测量400—700nm (根据还原型色原体组合 的不同而定)处吸光度上升的速度，得出铜浓度大小测定结果。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，如下成分关系的本专利技术铜诊断/测定试剂盒较为理想缓冲液 100 mmol/L稳定剂赖氨酸氧化酶过氧化物酶还原型色原体组合50 mmol/L 20 mmol/L 12000U/L 30000 U/L 0.1-20mmol/L所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何-水配对组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N-乙基一(3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2_苯噻唑酮腙 双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N,N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒2.4- 双氯石碳酸4-氨基抗砒2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒3.5- 双氯石碳酸磺酸 4-氨基抗砒3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒 双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺本专利技术的铜诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、赖氨酸、赖氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原 体组合。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、还原型色原体组合、赖氨酸。 试剂2缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合、赖氨酸氧化酶。过氧化物酶、还原型色原体组合、赖氨酸、赖氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水 溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂试剂1缓冲液、还原型色原体组合。试剂2缓冲液、还原型色原体组合、赖氨酸。 试剂3缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、赖氨酸氧化酶。 过氧化物酶、还原型色原体组合、赖氨酸、赖氨酸氧化酶在试剂1、 试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一本实施例的铜诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L赖氨酸 20 mmol/L赖氨酸氧化酶 12000 U/L过氧化物酶 30000 U/L 4-氨基抗砒2 mmol/L石碳酸 10mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间IO分钟，测试主波长505nm，测试副波长600nm，被测铜样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出铜的浓度大小。实施例二本实施例的铜诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂l三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 10Ommol/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酶比色法及酶联法技术的铜浓度测定方法，其方法原理如下： 赖氨酸＋氧＋水 赖氨酸氧化酶／Ｃｕ↑［２＋］ ６－氨基－２－氧代己酸＋氨＋过氧化氢 过氧化氢＋还原型色原体组合 过氧化物酶 吲嗒胺色原或醌亚胺色原＋水 将最终反应物置于可见光分析仪下，检测４００－７００ｎｍ处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度，得出铜浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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