筛选实验化合物的测定方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及筛选试验化合物在受试验者中诱发心脏毒性能力用的测定方法与试剂盒。所述测定方法与试剂盒基于下述发现：可利用阿司咪唑与ＨＥＲＧ钾通道的相互作用，以在新的治疗剂和其它试剂的开发过程中预计化合物的潜在心脏毒性。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及心血管安全测定领域，和提供筛选试验化合物在受试验者中诱发心脏毒性能力用的测定方法与试剂盒。所述测定方法与试剂盒基于下述发现可利用阿司咪唑与HERG钾通道的相互作用，以在新的治疗剂和其它试剂的开发过程中预计化合物的潜在心脏毒性。在化合物库的高通量筛选中，本专利技术尤其有利。
技术介绍
证据表明数种药物可延长心脏的复极化(因此以表面心电图的QT间期形式测量)到潜在地威胁生命的心室心律不齐的程度，例如可出现尖端扭转(TdP)(torsades de pointes)，尤其在过剂量或药代动力学相互作用的情况下。在有或无TdP情况下，所报道的诱发QT间期延长的药物数量持续增加(W.Haverkamp等(2000)Cardiovascular Research 47，219-233)。已经牵涉到多至50种临床可获得的或仍在研究的非-心血管药物和心血管非-抗-心律不齐药物。许多药物，既有老的，也有新的，已从市场上撤回或具有它们的销售限制。关心的是从这些药物上市到最初意识到它们与QT间期延长和/或TdP有关的时间间隔，通常以年为单位来测量。因此，在新的治疗剂和/或其它试剂开发的早期阶段，在人类中初次使用之前，研究任何新的化学物质的这一潜在副作用将是有益的。本专利技术开发的新型治疗剂的关键组分由化合物库的高通量筛选(HTS)组成。药物公司已建立了结构不同的化合物的大型集合，它充当药物靶向先导鉴定程序的起始点。典型的公司化合物集合现包括100000至1000000种不同的化学物质。尽管数年前，认为每天和每次测定数千种化合物的用量是足够的，但当今药物公司旨在具有每周测试数以十万计的化合物的超高通量的筛选技术。在涉及筛选形式的典型HTS中，在多-孔微量滴定板，如96、384或1536个孔的板中进行测定。使用这些板有助于自动化，如自动的试剂分配器和自动虹吸仪的使用。此外，为了降低周期时间、成本和生物化学物质的原料如重组蛋白质，对于在测定方法中测试的各化合物，优选在室温下，使用单一的测量，进行HTS有关的筛选。先导评价方法中的决定性标准将是早期识别它们与QT延长和/或TdP有关的可能性。然而，目前没有评价心脏毒性可获得的可靠、快速容易筛选方法，其中所述方法可对付在目前推广使用的HTS技术中鉴定的许多化合物。本专利技术的目的是通过提供测定和试剂盒来解决本领域的该问题，其中所述测定与试剂盒基于下述发现可利用阿司咪唑与HERG钾通道的相互作用，以预计在新的治疗剂和其它试剂的开发过程中化合物的心脏毒性。目前可获得的体外模型包括异源表达系统、解聚的细胞、分离的组织和分离的完整(兰根朵夫灌注的)心脏。在所有模型中，通过使用双电极电压钳记录，测量离子电流(DasscalN.(1987)Crit.Rev.Biochem.22，341-356)，或使用微电极或共焦显微镜(Dall`Asta V.等(1997)Exp.Cell Research 231，260-268)，测量膜电势的膜片钳记录(Zhou Z等(1998)Biophysical Journal74，230-241)，从而评价钾电流受阻的效果。鉴于实验程序的复杂性、慢的周期时间、原料的性质(即分离的组织及其解聚细胞)和试验结果的可靠性，在HTS筛选中不能使用前述方法。本专利技术者令人惊奇地发现，可使用利用标记的阿司咪唑作为HERG通道的特异配体的结合测定方法，来预计化合物与QT延长和/或TdP的潜在关系。这一结合测定方法解决了前述问题，并且可在HTS有关的筛选形式中推广使用。Chadwick C.等已描述了类似的测定方法(Chadwick C等，(1993)Circulation Research 72，707-714)，其中已鉴定-多非利特作为心脏延迟整流器K+-通道的特异放射配体。这篇文章进一步证明了多非利特的置换与许多抗心律不齐化合物的钾通道阻断活性之间具有良好的关联。这一结合测定有助于在分子水平上表征药物-通道的相互作用。在这一测定中，已由二溴前体，通过3H-交换制备标记的多非利特，从而在每个分子上掺入2个3H-标记。每个分子上3H-标记的数量与结合测定的敏感性之间存在直接的关联。本专利技术提供相对以上方法的改进结合测定，因为在与-碘化甲烷反应中使用去甲阿司咪唑前体导致在每分子的阿司咪唑中掺入3个3H-标记。由此获得的放射配体的比活性比-多非利特的比活性高1.5-2倍。此外，在HTS有关的筛选形式中不可能使用多非利特测定，因为从成年雄性豚鼠中分离的心室肌细胞必须在分离的6小时内使用。另外，仅36％分离的细胞是能存活的和可在结合测定中使用。为了在HTS有关的筛选中使用，起始材料应当可容易且足量地获得。本专利技术解决了该问题，因为使用了稳定表达HERG钾通道的HEK293细胞的膜制备物。所述细胞可足量地维持在温育物中，从而避免了需要并供应动物模型，并且由于在结合测定中使用细胞膜，所以可在-80℃下，在结合测定现成的等分试样中储存后者，用于随后使用。Chadwick等所述的多非利特结合测定的进一步的缺点是与温育程序有关。由于使用可存活的肌细胞，所以必须在34℃的生理温度下进行温育。若要在HTS有关的筛选形式中进行的话，后者毫无疑问增加了测定的成本、可能的周期时间和复杂性。本专利技术解决该问题，因为令人惊奇地证明，可在室温下温育膜制备物。特别地鉴于Zhoe Z.等，Zhou Z.等(1998)Biophysical Journal 74，230-241的研究，其中得出结论，对于HERG，所测量的动力学特性显著依赖于温度，当在生理温度，即35℃下进行研究时，在数个报告中观察到的差别减少。以下将描述本专利技术的这一和其它方面。专利技术概述本专利技术提供一种筛选试验化合物在受试验者中诱发心脏毒性能力用的测定方法。该方法包括用参考化合物和试验化合物温育含HERG或其片段的原料，其时间足以使参考化合物与HERG多肽通道结合和试验化合物与HERG多肽通道结合，并测量试验化合物对结合于HERG的参考化合物数量的影响。在本专利技术的优选实施方案中，测定方法包括用标记的参考化合物温育细胞，优选HEK293细胞的膜制备物，其中所述细胞在其表面上表达含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段的HERG多肽通道，其中所述标记的参考化合物是在受试验者中能诱发心律不齐的药物，优选所述标记的参考化合物是-阿司咪唑。与试验化合物一起温育，并测量试验化合物对结合到HERG多肽通道上的参考化合物的数量的影响。在进一步的实施方案中，测量装置由从温育混合物中除去未结合的标记的参考化合物的分离装置；和检测标记的参考化合物用的装置组成，其中后者优选包括由使用闪烁计数的放射标记测量装置组成。本专利技术进一步提供筛选化合物在受试验者中诱发心脏毒性能力用的高通量的测定方法，该测定方法包括a)使细胞的膜制备物与标记的参考化合物接触，其时间足以使参考化合物与HERG多肽通道结合，其中所述细胞在其表面上表达具有与SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段；b)使细胞的膜制备物与步骤a)的标记的参考化合物以及试验化合物接触，其时间足以使参考化合物与HERG多肽通道结合和试验化合物与HERG多肽通道结合，其中所述细胞在其表面上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选试验化合物的测定方法，该测定方法包括：　　　　ａ）用ｉ）参考化合物，　　　　ｉｉ）试验化合物　　　　温育含ＨＥＲＧ或其片段的原料；和　　　　ｂ）测量试验化合物对结合到ＨＥＲＧ上的参考化合物数量的影响。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：GICM海伦，CGM詹森，MR朱尔扎克，HPMM范阿索夫，
申请(专利权)人：詹森药业有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]