本发明专利技术公开了两种抗西尼罗病毒的单克隆抗体及其应用。本发明专利技术的抗西尼罗病毒的单克隆抗体是由保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２２６１的鼠源杂交瘤细胞株ＷＮＶ－２Ｆ５或保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２２６２的鼠源杂交瘤细胞株ＷＮＶ－４Ｂ３分泌的。本发明专利技术抗西尼罗病毒的单克隆抗体的抗原决定簇是西尼罗病毒囊膜上的膜蛋白Ｅ的第三结构域。本发明专利技术单克隆抗体经间接酶联免疫法筛选，并用免疫印迹分析、流式细胞仪检测、表面等离子共振分析、间接免疫荧光等方法全面鉴定了其与抗原结合的特异性和亲和力等特性，抗体经生物素标记后，建立了抗原捕获间接酶联免疫检测体系。本发明专利技术的抗西尼罗病毒的单克隆抗体可应用于西尼罗病毒抗原的多种检测方法中，也可应用于制备西尼罗病毒检测试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗西尼罗病毒膜蛋白E的单克隆抗体及其应用。技术背景西尼罗病毒(West Nile Virus, WNV)感染可引起西尼罗热、西尼罗病毒性脑炎 和脑膜炎，是一种人畜共患、自然疫源性、急性传染病。自1999年丽V在美国纽 约爆发以来，该病毒已经迅速传播到世界多个国家和地区，成为严重威胁人类健康 的病毒性疾病，引起了全球公共卫生界的关注。WNV可以感染多种蚊虫和鸟类，并 通过蛟虫和鸟类的交替感染将病毒沿着鸟类迁徙的路径进行传播；蚊虫还可以通过 叮咬被WNV感染的鸟类将WNV传染给多种哺乳动物，如人类、马、狗、猫和家禽如鸡、鹅等；该病毒还可以通过输血、器官移植、哺乳及胎盘垂直传播。截至目前全 球已有两万多人感染WNV，发病率在20%以上，与以前的丽V感染相比，重症病例 明显增加，死亡率上升为5 — 15%。目前对WNV感染的治疗还没有特效药物，早期发现是控制丽V传播的主要措施。 丽V已经在世界多个国家和地区发生多次的反复流行，虽然我国目前还没有丽V感 染的报道，根据美国CDC发布的丽V在全球的地理分布图显示，我国西部的部分地 区已经受到WNV入侵的威胁；而且，与我国毗邻的俄罗斯在1999年就爆发过丽V。 由于WNV可以通过迁徙的鸟类进行远距离传播，同时也可能通过牲畜的进口贸易进 入我国，且我国存在WNV流行的自然和社会因素，因此我国需尽快发展有效的丽V 检测试剂和检测方法，及时建立丽V监测体系，防止丽V的传入和流行。西尼罗病毒是虫媒病毒之一，属于黄病毒科黄病毒属，与日本脑炎病毒 (Japanese Encephalitis Vims, JEV)和登革热病毒(Dengue Virus, DEV)等属于同 一个复合组，其病毒粒子表面有两个膜蛋白M蛋白和E蛋白。其中E蛋白是主要 的膜蛋白，与病毒和受体细胞的识别、结合和病毒的毒力有关。晶体结构分析表明 E蛋白包含三个结构域即结构域I、 II和III，其中结构域III (EDIII)被认为 是诱导病毒特异性抗体和中和抗体的主要抗原表位。由于黄病毒属成员的E蛋白上 存在很多共同的抗原表位，所以在进行血清学检测时常常出现交叉反应，其抗体的 中和活性也有一定的交叉性，使得血清检测反应的特异性大大降低；而JEV在我国多个地区发生过流行，因此，黄病毒属病毒感染的血清学检测具有很大的局限性， 只能作为初筛的检测指标之一。WNV抗原的检测可以通过细胞培养分离技术和噬斑滴定、传统的RT-PCR、实时 荧光RT-PCR和免疫组织化学等方法进行。其中RT-PCR和实时荧光RT-PCR可以快 速检测病毒抗原，但该方法成本昂贵，容易出现由于样品污染而呈假阳性结果；通 过细胞培养技术分离病毒和检测样品中的病毒噬斑也可以检测病毒抗原，但该方法 检测周期长，且需要专业的技术人员以及BSL-3生物安全试验室，因而在大范围检 测中难以普及；而利用抗原捕获ELISA、间接免疫荧光、免疫组化等方法可以快速、 灵敏地检测WNV抗原，适于在大规模的监测系统中应用。抗原捕获ELISA、间接免疫荧光、免疫组化等检测方法的应用依赖于针对WNV 抗原特异性的单克隆抗体的研制。国外学者利用灭活的WNV、 DNA疫苗和WNV E蛋 白的胞外区作为抗原免疫小鼠制备的单克隆抗体中，部分单抗与黄病毒科的其它成 员有不同程度的交叉反应，但没有用复性的EDIII作为抗原制备单克隆抗体的报道。 面对丽V可能入侵我国并进行传播的威胁，需要及时建立有效的丽V检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供抗西尼罗病毒膜蛋白E的单克隆抗体。本专利技术所提供的抗西尼罗病毒膜蛋白E的单克隆抗体是丽V-2F5'或WNV-4B3'。 其中，丽V-2F5'是由保藏号为CGMCCNo. 2261的鼠源杂交瘤细胞株WNV-2F5分泌的， 丽V-4B3'是由保藏号为CGMCC No. 2262的鼠源杂交瘤细胞株丽V-4B3分泌的。鼠源杂交瘤细胞株WNV-2F5已于2007年11月26日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路甲3号， 中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo.2261。鼠源杂交瘤细胞株WNV-4B3 已于2007年11月26日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No. 2262。以上两种鼠源杂 交瘤细胞株WNV-2F5和丽V-4B3也属于本专利技术的保护范围。所述抗西尼罗病毒的单克隆抗体与抗原发生特异性结合的抗原决定簇位于西 尼罗病毒膜蛋白E的第三结构域。所述单克隆抗体通过间接酶联免疫反应、免疫印迹法、流式细胞仪检测技术、 表面等离子共振、间接免疫荧光法对抗体和抗原反应的特异性和亲和力进行鉴定， 结果表明..在间接酶联免疫反应中，0.002ug/ml的本专利技术的单克隆抗体丽V-2F5' 或丽V-4B3'即能与抗原发生特异性的结合反应；WNV-2F5'和WNV-4B3'与重组WNVEDIII蛋白的亲和力常数分别为1. 77 + 0. 3nM和407 + 96nM; WNV-2F5'和WNV-4B3' 与丽V感染细胞呈现强阳性荧光，其效价分别为5120和7680， 二者与JEV感染的 细胞均无交叉反应；抗原捕获酶联免疫检测法中，最低可以检测到10ng的重组 EDIII蛋白禾口 2. 8 TCID5。 / 0. lml的WNV病毒。本专利技术所提供的抗西尼罗病毒的单克隆抗体可以应用于西尼罗病毒抗原的检 测。在实际应用中，可在以下方法中使用本专利技术所提供的抗西尼罗病毒的单克隆抗 体进行检测间接免疫荧光检测法、抗原捕获酶联免疫检测法、免疫组织化学检测 法或试纸条检测法。其中，所述试纸条检测法即包括胶体金检测法或酶标检测法，还包括本领域技 术人员所熟知的其它抗体标记检测法。所述抗原捕获酶联免疫检测法中，可以丽V-2F5'为包被抗原，以丽V-4B3'为 检测抗体检测待测样品。本专利技术所提供的抗西尼罗病毒的单克隆抗体还可应用于制备西尼罗病毒检测 试剂盒。含有所述抗西尼罗病毒的单克隆抗体的试剂盒也属于本专利技术的保护范围。 附图说明图1为WNV-2F5'与变性抗原的免疫印迹反应图2为用流式细胞仪检测丽V-2F5'和WNV-4B3'与非变性抗原蛋白的结合能力 图3为纯化的WNV-4B3'与固定在CM5芯片上的重组EDIII蛋白的结合动力学曲线 图4为纯化的WNV-2F5'与固定在CM5芯片上的重组EDIII蛋白的结合动力学曲线 图5为用间接免疫荧光反应检测WNV-2F5'和WNV-4B3'与感染BHK21细胞的西尼罗病毒抗原的结合图6为抗原捕获ELISA检测细胞培养上清中WNV的敏感性测定 图7为抗原捕获ELISA检测重组蛋白EDIII抗原的敏感性测定具体实施方式以下实施例中所涉及的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。 本专利技术中涉及西尼罗病毒活病毒的操作均在中国军事医学科学院微生物流行 病研究所的BSL-3实验室完成。实施例1、单克隆抗体丽V-2F5'或WNV-4B3'的获得能分泌单克隆抗体WNV-2F5'或WNV-4B3'的鼠源杂交瘤细胞株WNV-2F5或 WNV-4B3是专利技术人按照以下方法制备的1)利用大肠杆菌表达系统体外表达西尼罗病毒膜蛋白E的第三结构域蛋白，经纯化获得重组的EDII本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗西尼罗病毒膜蛋白Ｅ的单克隆抗体，是由保藏号为ＣＧＭＣＣＮｏ．２２６１的鼠源杂交瘤细胞株ＷＮＶ－２Ｆ５或保藏号为ＣＧＭＣＣＮｏ．２２６２的鼠源杂交瘤细胞株ＷＮＶ－４Ｂ３所分泌的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高福，田克恭，刘俊娥，曹振，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，农业部兽医诊断中心，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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