一种ＤＮＡ的荧光检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种ＤＮＡ的荧光检测方法及其试剂盒。该方法将捕获探针连接在磁性颗粒表面后通过ＤＮＡ之间的杂交捕获靶向ＤＮＡ，靶向ＤＮＡ的另一段核苷酸序列与荧光素修饰的信号探针杂交，形成磁性颗粒－靶向ＤＮＡ－荧光标记的信号探针的三明治夹心结构，同时加入上述的捕获探针或信号探针的竞争性探针与靶向ＤＮＡ竞争结合，最后加入具有信号倍增功能的水溶性的共轭高分子对信号放大检测，从而检测出靶向ＤＮＡ。本发明专利技术可以显著提高基因及基因突变检测的选择性和灵敏度，无需进行核酸扩增，操作快速简便，在生物检测、疾病的早期诊断和治疗中有着重要的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种DNA的荧光检测方法及其试剂盒。
技术介绍
基因(DNA或RNA)是遗传信息的载体，在生物的个体生长、发育、繁殖、遗传和变异等生命过程中起着极为重要的作用。基因检测在临床诊断、单核苷酸多态性分析、基因测序、环境分析、反控等领域具有重要的意义。随着人们对自身健康的日益关注，对肿瘤、癌症等重大疾病早期诊断技术的要求也越来越高，因此迫切需要发展高灵敏度的基因检测技术。基因突变是单核苷酸多态性的形式之一，与多种疾病的发生有着密切的关系，最新研究表明，有四百多种疾病的发生与基因突变有关。为了在发病早期就能检测到极微量致病基因的存在，常常需要对待测基因进行PCR扩增或采用其它形式的信号放大方法，如纳米金放大、共轭高分子放大、酶联放大等(L. Pang， J. Li， J. Jiang， G. Shen， R. Yu， Anal.Biochem. 2006， 358， 99 ;D. Q. Tang， D. J. Zhang， D. Y. Tang， H. Ai， J. Immunol. Methods 2006，316， 144 ;X. Yao， X. Li， F. Toledo, C. Zurita-Lopez， M. Gutova， J. Momand， F. Zhou， Anal.Biochem. 2006，354，220)。 本申请人公开号为CN1808101A的专利申请中公开了一种DNA的荧光检测方法及其试剂盒，该检测方法包括利用连接于磁性颗粒上的捕获探针将待检DNA从生物样品中进行磁性富集和分离；然后加入荧光基团(FAM)标记的信号探针，使磁性分离和富集后的待检DNA与信号探针杂交配对，并用低盐缓冲液洗涤；再加入水溶性导电高分子材料，即共轭高分子(如聚芴衍生物PF)实现信号倍增，用该导电高分子材料的激发波长作荧光光谱，利用荧光共振能量转移(FRET)检测方法检测分析出待检DNA。该方法具有较高的特异度和敏感度。但是，一方面低盐洗涤的过程会增加操作的步骤，延长反应和检测时间；另一方面，低盐溶液也会使完全互补的双链DNA部分解链，从而使互补与突变的可区分性减小，即会降低对突变的选择性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种选择性更佳的DNA的荧光检测方法，而且该方法灵敏度高，无需扩增，操作快速简便，综合性能高。 本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种采用上述DNA的检测方法的试剂盒。 本专利技术人在上述CN1808101A公开的技术方案基础上，经过进一步的研究，发现采用竞争机制，磁性颗粒对靶向DNA的富集、分离，以及水溶性共轭高分子与荧光基团之间的FRET技术相结合，可以大大提高DNA检测的特异度和灵敏度，縮短了反应时间，综合性能更佳，特别可用于基因及突变基因的检测，更有希望应用于一些与基因突变有关的病症，如肿瘤的诊断。其中，竞争机制是生物检测中经常采用的一种用于提高选择性的检测方法，如ELISA竞争法和竞争性PCR等。在基因(DNA)检测中，也常采用这种方法。与线性DNA分子相比，茎环结构DNA探针由于可以形成特定的茎环结构，与其互补的靶向DNA结合时具有更窄的融解温度范围和更高的选择性(G. Bonnet, S. Tyagi， A. Libchaber， F. Kramer, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999， 96， 6171)，常用于单碱基错配的检测。因此，茎环结构竞争探 针的引入将会进一步提高DNA生物传感器的综合性能。 因此，本专利技术解决上述第一个技术问题所采用的技术方案是一种DNA的荧光检 测方法，包括以下步骤 1)将捕获探针连接在磁性颗粒表面； 2)加入待测的靶向DNA和荧光素修饰的信号探针，该捕获探针能与靶向DNA的一段核苷酸序列杂交，该信号探针能与靶向DNA的另一段核苷酸序列杂交，通过DNA之间的杂交，形成磁性颗粒_靶向DNA-荧光素修饰的信号探针的三明治夹心结构； 3)最后除去游离的荧光素修饰的信号探针后，加入具有信号倍增功能的水溶性的共轭高分子，对该信号探针上的荧光信号进行放大检测，从而检测出靶向DNA ; 其中，步骤2)在杂交时还加入上述捕获探针或信号探针的竞争性探针，与靶向DNA竞争结合。 优选的，所述的捕获探针可以是茎环结构的DNA探针，同时所述的信号探针是线 性DNA探针，所述的竞争性探针无任何修饰，其序列组成与捕获探针仅相差一个碱基。 优选的，所述的捕获探针可以是线性DNA探针，同时所述的信号探针是茎环结构 的DNA探针，所述的竞争性探针无任何修饰，其序列组成与信号探针仅相差一个碱基。 优选的，步骤2)中所述的杂交反应的温度可以是29t: 39t:，优选的是37t:左 右。通过控制反应的温度条件，使磁性颗粒_靶向DNA-荧光素修饰的信号探针的三明治夹 心结构中含有单点突变的双链在此条件下解链，成为游离状态，而完全互补的双链不受影 响。 优选的，所述的竞争性探针加入的摩尔量可以是被竞争探针的1 7倍，优选的是 2倍左右。 根据本专利技术，步骤1)所说的磁性颗粒同现有技术，如上述CN1808101A中所述，其 已被广泛用于生物活性物质的富集、分离、药物的磁靶向以及疾病的诊断和治疗等方面。功 能化后的磁性颗粒不仅可以通过表面的配体(或受体)与受体(或配体)之间的特异相互 作用，如亲和素-生物素(biotin)来实现对靶向生物目标的快速分离，而且可以作为固相 载体用于连接生物分子。与传统分离方法相比，使用磁性颗粒进行分离的速度明显縮短，在 30秒内即可实现快速分离。此外，利用磁性颗粒可以实现对靶向物质分析时反应与检测分 开进行，避免了反应体系中其它组分的干扰。本专利技术中的磁性颗粒通常选用可市购的链亲 和素包覆的微米级的磁珠(匪Ps)商品，也可以是根据现有方法合成的直径为50 100nm 的磁性纳米粒子。当采用微米级的匪Ps时，为了避免磁珠对光的散射，在荧光检测前通 常需使固定在磁珠上的DNA变性解链，而所选用的变性解链方法可以是常规方法，如加入 NaOH等强碱(具体可参见CN1808101A)。 根据本专利技术，步骤3)中所述的共轭高分子优选水溶性聚芴(PF)。本专利技术采用微米 级的磁珠匪Ps为例来说明，在含有变性分离下来的信号探针的上清液中，加入水溶性的共 轭高分子PF再进行荧光检测，通过PF与荧光素之间的荧光共振能量转移实现信号放大。 本专利技术解决上述第二个技术问题所采用的技术方案是一种DNA荧光检测的试剂 盒，包括 1)连接于磁性颗粒上的捕获探针，荧光素修饰的信号探针； 2)上述捕获探针或信号探针的竞争性探针； 3)水溶性聚荷。 本专利技术引入竞争机制，特别是具有高选择性的茎环结构的竞争性探针，提高了DNA 检测的选择性；同时以功能化的磁性颗粒作为磁性颗粒，实现游离组分的快速分离，进一步 提高了选择性。本专利技术同时选择荧光素修饰的信号探针，在最后检测时直接加入共轭高分 子，通过其与荧光素之间的荧光共振能量转移，实现信号倍增。不但提高了 DNA检测的灵敏 度，而且无需对信号探针进行扩增，操作简便。本专利技术可以显著提高DNA及DNA突变检测， 特别是基因，如乳腺癌易感基因BRCA1及其突变基因检测的选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ的荧光检测方法，包括以下步骤：１）将捕获探针连接在磁性颗粒表面；２）加入待测的靶向ＤＮＡ和荧光素修饰的信号探针，该捕获探针能与靶向ＤＮＡ的一段核苷酸序列杂交，该信号探针能与靶向ＤＮＡ的另一段核苷酸序列杂交，通过ＤＮＡ之间的杂交，形成磁性颗粒－靶向ＤＮＡ－荧光素修饰的信号探针的三明治夹心结构；３）最后除去游离的荧光素修饰的信号探针后，加入具有信号倍增功能的水溶性的共轭高分子，对该信号探针上的荧光信号进行放大检测，从而检测出靶向ＤＮＡ；其特征是步骤２）在杂交时还加入上述捕获探针或信号探针的竞争性探针，与靶向ＤＮＡ竞争结合。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋世平，刘兴奋，李江，王丽华，樊春海，
申请(专利权)人：中国科学院上海应用物理研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]