本发明专利技术的作为特异性识别肿瘤细胞的探针分子的制备方法属于纳米材料和生物技术领域。该方法有以下步骤：（１）用生物相容的叶酸来修饰两侧为氨基的ＰＥＧ；（２）把连有叶酸的ＰＥＧ修饰到树枝状分子ＰＡＭＡＭ表面；（３）通过配体交换的方法把量子点表面的油溶性配体取代下来，从而制备了水溶性的量子点。本发明专利技术使得量子点可以特异性地识别表达有高水平叶酸受体的癌细胞，从而可以作为荧光探针用于细胞学研究；同时，把ＰＡＭＡＭ和ＰＥＧ修饰到量子点表面可以很大程度地提高量子点的稳定性；而且ＰＡＭＡＭ和ＰＥＧ都有很好的生物相容性和很小的毒性，使其在生物学上的应用提供了可行性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纳米材料和生物
；涉及的是连有叶酸的树枝状聚酰胺-胺包覆油溶性量子点的制备方法，制备一种水溶性的、用作特异性识别肿瘤细胞 的探针分子。
技术介绍
量子点是指半导体纳米微晶，主要是n-vi族或ni-iv族元素组成的纳米粒 子。由于其量子尺寸效应而具有奇特的性质，包括荧光发射波长可控、激发波谱 宽而连续、荧光强、光稳定好、耐光漂白、能实现一元激发多元发射的同时多色 标等独特性能，可弥补现有有机荧光染料的不足，甚至在某些情况下可替代有机 荧光染料。量子点的独特性能将有利于其在医学实验和临床检测上的应用，相比 传统荧光试剂在生物分析方面有着巨大的优势。目前，量子点在生物医学研究中的应用越来越受到重视。最主要是作为生物 荧光探针标记物。但现在通常使用的量子点表面都被大量有机溶剂分子TOPO/TOP， ODA等包覆而呈疏水性，而生物大分子或者药物一般是溶解或分 散在水溶剂中的，所以必须进行水溶性改进。目前报道的量子点(QDs)的修饰 方法大致可以分为以下几种(1)通过双功能分子连接改性。主要是利用Zn、 Cd等II族原子与硫原子之间有效的键合作用，用带有巯基的双功能分子，如巯 基羧酸类、二硫苏糖醇(DTT)、硫代胆碱等取代QDs表面的有机分子，以使其 从疏水性转变为亲水性，然后通过另一端的功能基团可以与生物大分子连接，这 种方法简单、重复性好，但由于使用的是小分子作为连接物，修饰以后原有的有机分子对量子点的保护和稳定性得不到有效的替代，所以稳定性不好，荧光性质 也大大减弱。(2)通过在QDs表面包覆硅或硅垸等进行修饰。修饰后的量子点 稳定性、水溶性以及进一步连接的可操作性都比较理想，但是修饰过程极为烦琐、 周期长、重复性无法保证。(3)将聚合物直接包埋入聚合物的空腔或形成的疏水 腔。由于采用这类方法量子点表面的有机分子没有损失，所以其性能基本不受影 响。但是，这种方法包覆的量子点的粒径较大，不利于在生物方面的应用。(4)通过双亲性高分子与量子点表面的烷基链疏水作用实现包裹，由于这种方法也未 破坏量子点表面的有机分子，其光学性质也基本不受影响，但使用大量的有机溶 剂，过程复杂，纯化困难。肿瘤是危害全人类的头号疾病。肿瘤的早期诊断、早期治疗和靶向治疗是人 们一直关注和研究的内容。申请号为200610098270.6的专利技术专利公开了一种特 异性识别肿瘤细胞的功能化量子点的制备方法，该方法包括以下步骤组成 (1)CdS量子点的制备;(2)选择带有巯基的小分子化合物对量子点进行表面改性； (3)量子点表面功能化修饰经过上步对量子点的表面进行改性之后，加入NHS 及EDC的DMSO溶液使体系中形成一种活性比较高的中间体，可以和随后加 入的叶酸上的氨基反应。由于用含有巯基的小分子修饰量子点的表面，改善了水 溶性。再通过一种有效的方法将叶酸和量子点连接起来，使得这些荧光量子点可 以特异性地识别表达有高水平叶酸受体的癌细胞，从而可以用作荧光探针用于细 胞生物学研究。该方法提高了量子点的特异性靶向功能。但是，选用巯基小分子 化合物对量子点进行了表面改性，小分子不能有效的保护量子点；此夕卜，量子点 表面的巯基在光照的条件下，很容易生成二硫化物，二硫化物不能与量子点表面 相作用，从而会从量子点表面脱落下来。因此，用巯基小分子化合物对量子点进 行了表面改性，量子点的稳定性会较差。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了采用连有叶酸的聚酰胺-胺树枝状分子对油溶性量 子点进行包覆的方法，制备了一种用作特异性识别肿瘤细胞的功能化的量子点， 以提高量子点的特异性靶向功能，尽可能地降低非特异性染色的强度，适应了细 胞生物学研究的需要。聚酰胺-胺(PAMAM)是一种纳米级树枝状聚合物，PAMAM树枝状大分子 是近年来合成并迅速发展的一类新型聚合物。该聚合物与传统的聚合物相比，可 在纳米水平上严格控制设计分子大小、结构和表面基团，因而具有精确的分子结 构、致密的球状外形、单分散性、极好的水溶性、粒径较小等。本专利技术用其来包 覆量子点，可以取代量子点表面的油溶性配体，使量子点转变为水溶性的。同时 由于PAMAM有很好的生物相溶性，还可以增加量子点的生物相容性，而且得 到的量子点的粒径也会很小。本专利技术的一种用作特异性识别肿瘤细胞的功能化量子点的制备方法，应用于 制备检测细胞膜上表达有高水平叶酸受体的肿瘤细胞，其制备有以下步骤(1) 用生物相容的叶酸来修饰两侧为氨基的聚二乙醇(PEG)。(2) 把连有叶酸的PEG修饰到树枝状分子表面。(3) 通过配体交换的方法把量子点表面的油溶性配体取代下来，从而制备了水溶性的量子点。具体的技术方案如下一种，其特征在于，有聚乙二醇-叶酸(NH2-PEG-FA)的合成、表面连有氨基的树枝状分子-聚乙二醇-叶酸 的合成、功能性量子点(QDs-PAMAM-PEG-FA)制备的过程所述的聚乙二醇-叶酸的合成，是用生物相容的叶酸来修饰两侧为氨基的聚 二乙醇(PEG)，合成出一侧为氨基另一侧为叶酸的聚乙二醇；所述的树枝状分子-聚乙二醇-叶酸的合成，是将聚酰胺-胺溶解在水或甲醇 中；在冰盐浴的条件下，按聚酰胺-胺和叶酸的摩尔比为1 : 1 128，将聚酰胺-胺溶液滴加一侧为氨基另一侧为叶酸的聚乙二醇中，滴加完毕撤掉冰盐浴，室温 反应4 48小时得到中间产物。再在冰盐浴的条件下，按聚酰胺-胺和乙二胺的摩 尔比为1:2 32，直接将中间产物滴加到乙二胺中，滴加完毕撤掉冰盐浴，室 温反应4 48小时；除去溶剂得到浅黄色固体，经过透析处理得到表面连有氨基 的树枝状分子-聚乙二醇-叶酸；所述的功能性量子点制备，是将表面连有油溶性配体的量子点溶解在氯仿或 甲苯中，中间产物溶解在甲醇或水中，将两种溶液混合，用四甲基氢氧化胺控制 pH值在6 12之间，在40 80'C反应2 10小时，冷却至室温后，用乙酸乙酯或 丙酮洗后，得到的固体溶解在水中，过滤除去溶剂后得到目标产物(QDs-PAMAM陽PEG-FA)。聚酰胺-胺(PAMAM)由0代至10代，其分子直径在lnm至13nm之间， 属于纳米尺度的分子。本专利技术所述的聚酰胺-胺可以是2.5~6.5代的树枝状聚合 物。在树枝状分子-聚乙二醇-叶酸的合成中，PAMAM应当透析提纯后使用。所述的聚乙二醇-叶酸的合成，可以采用一步法或者多步法。一步法聚乙二醇-叶酸合成的具体过程是，将等摩尔的叶酸和两侧为氨基的聚乙二醇溶解在二甲亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入与聚 乙二醇-叶酸等摩尔量的N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)，和与聚乙二醇-叶酸等 摩尔量的三乙胺或吡啶，室温反应3 24小时；混合溶液经离心后，上清液用PH =6~12的缓冲溶液透析，再用去离子水透析；除去溶剂后，得到浅黄色固体， 即为一侧为氨基另一侧为叶酸的聚乙二醇(NH2-PEG-FA)。一步法的叶酸与两侧为氨基的PEG的反应式如下:多步法聚乙二醇-叶酸合成的具体过程是，(1)将等摩尔量的两侧为氨基的 聚乙二醇和二碳酸二叔丁酯溶解在甲醇中，然后向其中滴加三乙胺或吡啶，回流 搅拌8~20小时，冷却至室温，旋蒸，除去溶剂；再用二氯甲烷溶解，在-l(TC 2(TC下，用体积比为l : 1 5的乙醚己垸混合溶剂沉淀，过本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种作为特异性识别肿瘤细胞的探针分子的制备方法，其特征在于，有聚乙二醇－叶酸的合成、表面连有氨基的树枝状分子－聚乙二醇－叶酸的合成、功能性量子点制备的过程： 所述的聚乙二醇－叶酸的合成，是用生物相容的叶酸来修饰两侧为氨基的聚二乙醇（ＰＥＧ），合成出一侧为氨基另一侧为叶酸的聚乙二醇； 所述的树枝状分子－聚乙二醇－叶酸的合成，是将聚酰胺－胺溶解在水或甲醇中；在冰盐浴的条件下，按聚酰胺－胺和叶酸的摩尔比为１∶１～１２８，将聚酰胺－胺溶液滴入一侧为氨基另一侧为叶酸的聚乙二醇中，滴加完毕撤掉冰盐浴，室温反应４～４８小时得到中间产物；再在冰盐浴的条件下，按聚酰胺－胺和乙二胺的摩尔比为１∶２～３２，直接将中间产物滴加到乙二胺中，滴加完毕撤掉冰盐浴，室温反应４～４８小时；除去溶剂得到浅黄色固体，经过透析处理得到表面连有氨基的树枝状分子－聚乙二醇－叶酸； 所述的功能性量子点制备，是将表面连有油溶性配体的量子点溶解在氯仿或甲苯中，中间产物溶解在甲醇或水中，将两种溶液混合，用四甲基氢氧化胺控制ｐＨ值在６～１２之间，在４０～８０℃反应２～１０小时，冷却至室温后，用乙酸乙酯或丙酮洗后，得到的固体溶解在水中，过滤除去溶剂后得到目标产物。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王静媛，赵义丽，宋艳涛，李亚鹏，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]
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