分泌中和腐败梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用制造技术

本发明专利技术公开了分泌中和腐败梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用。属于生物技术领域。本发明专利技术筛选到一株分泌中和腐败梭菌α毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCCNo.19400，并利用该杂交瘤细胞株制备单克隆抗体3D8，建立了腐败梭菌α毒素抗体的阻断ELISA检测方法。与现有技术相比，本发明专利技术取得的有益效果为：单克隆抗体3D8在小鼠体外能够中和腐败梭菌天然毒素，其中和效价可到达2个小鼠MLD/0.1mL；利用单克隆抗体3D8建立了一种腐败梭菌α毒素抗体的阻断ELISA检测方法，该方法对腐败梭菌α毒素抗体的最低检测中和效价可达到0.625个小鼠MLD/0.1mL。

【技术实现步骤摘要】
分泌中和腐败梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用
本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及分泌中和腐败梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用。
技术介绍
腐败梭菌是一种能够引起人以及牛、羊、马、猪、水貂、鸡等多种动物发病的厌氧菌，对人类的健康和畜禽养殖业危害极大。该菌的主要感染途径是创伤感染，从而引起机体的恶性水肿。此外，该菌可通过消化道感染引起羊的一种以突然发病、病程短、多呈急性死亡、真胃发生出血性炎症为主要特征的急性致死性传染病-羊快疫。因此，对腐败梭菌病的早期诊断尤为重要，而与该菌致病性有直接关系的腐败梭菌α毒素(CSA)是诊断该病的重要指标。由于腐败梭菌引起的疾病具有发病急、死亡率高等特点以及没有特效治疗药物等原因，疫苗免疫成为了预防该菌感染的主要途径。目前，通过灭活腐败梭菌培养物上清而制备的商品化天然类毒素疫苗是预防该菌感染的主要疫苗，但该类疫苗制备过程繁琐，抗原成分复杂，有效抗原(CSA)含量较低。鉴于CSA与致病性的直接关系，利用原核表达技术获得了重组CSA及其无毒突变体，并验证了以上重组蛋白对腐败梭菌天然毒素具有优良的抗原保护性，是腐败梭菌病亚单位疫苗的重要候选抗原。然而，由于缺乏腐败梭菌α毒素的快速检测方法，导致我国腐败梭菌相关疫苗的效检方法只能选择操作繁琐的血清中和法或免疫攻毒法。此外，目前腐败梭菌相关研究和疫苗检验中，抗体阴性动物的筛选只能选择传统的血清中和法，但该方法不仅操作繁琐，且敏感度较低(最低检测线为1个小鼠MLD/0.1mL)。为此，急切需要建立快速、灵敏、特异的腐败梭菌α毒素的检测方法。单克隆抗体的制备是建立优良ELISA检测方法的基础，而免疫原是单克隆抗体制备的关键。以可溶性表达的重组CSA及其无毒突变体的抗原保护性均高于以包涵体形式表达的重组CSA及其无毒突变体。此外，将CSA分为N端和C端分别表达后，重组蛋白几乎丧失了抗原保护性，这说明保持CSA的天然构象是其抗原保护性的关键。然而，虽然可溶性表达的重组CSA具有与天然CSA最相近的特性，但该重组毒素具有很强的毒力，需要进行灭活处理。综上，如何提供一种应用于腐败梭菌α毒素抗体的阻断ELISA检测的单克隆抗体及检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了分泌中和腐败梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为鼠源杂交瘤细胞，命名为CP3D8，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年03月31日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.19400。一种杂交瘤细胞株的筛选方法，包括如下步骤：(1)重组腐败梭菌α毒素(rCSA)、重组腐败梭菌α毒素无毒突变体(rCSAm4△11)以及腐败梭菌天然毒素的制备；(2)以重组腐败梭菌α毒素(rCSA)作为免疫抗原免疫小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞融合，得到融合细胞；(3)以重组腐败梭菌α毒素无毒突变体(rCSAm4△11)为包被抗原对所述融合细胞进行筛选，得到阳性杂交瘤细胞；(4)用腐败梭菌天然毒素对所述阳性杂交瘤细胞的细胞上清进行血清中和实验，并采用有限稀释法进行3～5次亚克隆筛选，得到有中和腐败梭菌α毒素杂交瘤细胞株。优选的，所述重组腐败梭菌α毒素、所述重组腐败梭菌α毒素无毒突变体的制备方法如下：(1)人工合成获得基因片段Gcsa以及基因片段Gcsam4△11；所述基因片段Gcsa的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述基因片段Gcsam4△11的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；(2)将基因片段Gcsa和基因片段Gcsam4△11分别克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化，从而获得重组腐败梭菌α毒素(rCSA)以及重组腐败梭菌α毒素无毒突变体(rCSAm4△11)。①利用纯度为90％以上的rCSA作为免疫抗原确保了在最大程度上保持CSA的天然构象，同时又避免了腐败梭菌天然α毒素繁琐的纯化步骤和生物安全隐患；②利用纯度为90％以上的rCSAm4△11作为包被抗原进行阳性克隆与亚克隆的筛选，既确保包被抗原的纯度，又解决了rCSA具有高毒力的安全隐患；③利用腐败梭菌天然毒素进行单克隆抗体的血清中和试验，从而获得对腐败梭菌天然α毒素具有中和抗性的单克隆抗体杂交瘤细胞株。一种杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。优选的，命名为单克隆抗体3D8，能够中和腐败梭菌α毒素。单克隆抗体在腐败梭菌α毒素抗体的阻断ELISA检测中的应用。本专利技术利用灭活的rCSA作为免疫原免疫小鼠，用rCSAm4△11进行腐败梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选以及后续ELISA检测方法的建立，从而在最大程度上保持CSA天然构象的同时，极大地避免了不必要的生物安全隐患。优选的，可用于自然环境中腐败梭菌的检测、腐败梭菌α毒素抗体阴性动物的筛选或腐败梭菌类疫苗的效力检验。优选的，所述包被抗原为重组腐败梭菌α毒素无毒突变体。优选的，抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体的工作稀释度为1:10，单克隆抗体3D8的工作浓度为0.03125μg/mL。优选的，抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体的作用时间为1h，酶标二抗的稀释浓度为1:10000，酶标二抗的反应时间为1h。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果为：(1)首次获得分泌中和抗性的腐败梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能够稳定、高效的分泌中和活性的单克隆抗体，并能实现大规模批量生产，该单克隆抗体在小鼠体外能够中和腐败梭菌天然毒素，其中和效价可到达2个小鼠MLD/0.1mL，从而为临床预防和治疗腐败梭菌发病动物特效药物的制备提供重要材料。(2)首次利用具有中和抗性的腐败梭菌α毒素单克隆抗体建立了一种腐败梭菌α毒素抗体的阻断ELISA检测方法，该方法对腐败梭菌α毒素抗体的最低检测中和效价可达到0.625个小鼠MLD/0.1mL，低于血清中和法的最低检测线(1个MLD/0.1mL)。(3)样品操作简便、成本低廉、反应快速、特异性强、敏感性高，从而不仅能够为腐败梭菌病的诊断提供参考，也为腐败梭菌抗体阴性动物的筛选和相关疫苗效力检验替代方法的研究提供了基础。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术实施例1中纯化的rCSA的SDS-PAGE鉴定图，图中：M:Proteinmarker；1:BSA(1μg)；2:纯化的rCSA；图2附图为本专利技术实施例1中纯化的rCSAm4△11的SDS-PAGE鉴定图，图中：M:Prot本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为鼠源杂交瘤细胞，命名为CP3D8，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年03月31日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.19400。/n

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为鼠源杂交瘤细胞，命名为CP3D8，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年03月31日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.19400。


2.如权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)重组腐败梭菌α毒素、重组腐败梭菌α毒素无毒突变体以及腐败梭菌天然毒素的制备；
(2)以重组腐败梭菌α毒素作为免疫抗原免疫小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞融合，得到融合细胞；
(3)以重组腐败梭菌α毒素无毒突变体为包被抗原对所述融合细胞进行筛选，得到阳性杂交瘤细胞；
(4)用腐败梭菌天然毒素对所述阳性杂交瘤细胞的细胞上清进行血清中和实验，并采用有限稀释法进行3～5次亚克隆筛选，得到有中和腐败梭菌α毒素杂交瘤细胞株。


3.如权利要求2所述的一种杂交瘤细胞株的筛选方法，其特征在于，所述重组腐败梭菌α毒素、所述重组腐败梭菌α毒素无毒突变体的制备方法如下：
(1)人工合成获得基因片段Gcsa以及基因片段Gcsam4△11；
所述基因片段Gcsa的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
所述基因片段Gcsam4△11的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
(2)将基因片段Gcsa和基因片段Gcsam4...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘莹，杜吉革，陈小云，李双星，张秀坤，王磊，杨承槐，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京;11