一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株及应用。所述细胞株命名为人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株CACO‑2 KO，于2019年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO.C202024。是基于CRISPR/cas9技术利用SEQ ID NO：2‑3所示的一对gRNA构建的质粒载体电转染待敲除细胞，经抗性和测序筛选而获得。本发明专利技术设计的gRNA能够精确且高效的敲除TRPV1基因，有效的构建了一种敲除TRPV1基因的人结直肠腺癌细胞系。TRPV1基因敲除细胞系的建立，为研究辣椒素作用机理提供了有效的基因素材和基因工具。

【技术实现步骤摘要】
一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株及应用
本专利技术属于基因工程
，具体地说，涉及一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株及应用。
技术介绍
CRISPR/Cas9系统是一种高效、可编程的基因组编辑工具，它的最新发展彻底改变了基础科学研究，已被证明是一项重大的科学突破。基于CRISPR/Cas9系统的技术为研究人员提供了新的强大工具，可以创建精确的人类疾病细胞和动物模型。与TALENs和ZFs使用的蛋白质引导的DNA裂解不同，CRISPR/Cas9依赖于一个小RNA来来识别敲除靶点,从而引入一个位点特异性的双链DNA断裂，它的开发使基因编辑变得更加容易。CRISPR/Cas9技术从诞生之始就在新型动物模型上的得到广泛的应用，在此之前，敲基因动物模型的构建是一个耗时、费力，昂贵的过程，减慢了基因工程动物模型的产生,而CRISPR/Cas9技术实现了对多种细胞模型和动物模型进行快速基因修饰的作用，而且还可以同时靶向多个基因，获得多基因敲除的细胞和动物模型。人结直肠腺癌细胞（Caco-2）是一种常用的细胞模型。虽然Caco-2细胞虽然起源于结肠，但看起来像人小肠粘膜细胞，在基底外侧和顶室有紧密的连接、刷状边界、外排和摄取转运蛋白。在标准培养条件下，在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上的Caco-2可融合并分化为与肠上皮具有相同功能和形态的连续的人结肠癌的细胞层。由于具有相同的生物活性和模拟人体肠道的微绒毛结构，Caco-2细胞模型常被用来进行模拟体内药物转运和吸收机制实验。在过去的几十年里，很多学者对Caco-2细胞单层的细胞通透性进行了广泛的研究。结果发现与其他亲代细胞模型相比，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞类似，比较适合用于吸收机制的研究。辣椒素对肠道脂类吸收的影响的体外实验常采用Caco-2作为模型细胞。TRPV1是瞬时受体电位家族的一员，是一种无选择的阳离子通道。其作为一个多调受体，可在多种物理、化学因素刺激下激活或致敏，从而介导肌肉收缩、神经元活动、递质释放、细胞增殖和凋亡等多种细胞的基本活动。TRPV1是辣椒素的受体，它的激活是辣椒素发挥其降糖降脂作用关键，因此，TRPV1基因对于研究辣椒素的作用机理至关重要。目前对于辣椒素功能机理的研究多采用TRPV1受体拮抗剂作为对照试验。拮抗剂辣椒卓平的使用虽然广泛，但是其有一定的局限性。第一，实验中拮抗剂的用量很难掌握，要经过不同剂量的试验，才能找到合适的抑制浓度；第二，拮抗剂本身对试验动物或细胞具有一定的毒性作用，用量过多的话又导致实验失败的可能；第三，拮抗剂在试验动物体内或者细胞中的与辣椒素的代谢速度不同，代谢速度大于辣椒素，会导致拮抗作用失效，影响实验结果。因此，有必要提供一种商品化的TRPV1敲基因细胞模型。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对上述的问题，提供了一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株及应用。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株，命名为人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株CACO-2KO，于2019年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO.C202024。本专利技术还公开了一种用于敲除TRPV1基因的sgRNA的识别序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还公开了一种用于构建人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株的gRNA引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示。本专利技术还公开了一种上述的sgRNA的识别序列和/或gRNA引物对在敲除TRPV1基因中的应用。本专利技术还公开了一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株的构建方法，通过CRISPR/Cas9技术构建，将核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示的单链DNA进行退火反应，得到双链DNA短片段，连接入CRISPR/Cas9载体，获得重组敲除载体，将重组敲除载体电转染到人结直肠腺癌细胞系中，经抗性和测序筛选获得人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株CACO-2KO。本专利技术还公开了一种含有SEQIDNO：2～3所示的gRNA引物对的质粒载体。本专利技术还公开了一种上述的质粒载体在构建人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株中的应用。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：本专利技术利用gRNA，精确且高效的敲除了TRPV1基因，有效的构建了一种TRPV1基因敲除的人结直肠腺癌细胞系，解决了使用辣椒素受体拮抗剂的缺陷，为辣椒素降脂、降糖、抗炎症等功能的机理研究奠定物质基础。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1为本专利技术靶点序列的设计位点图；图2为本专利技术电转化条件优化图；图3为本专利技术构建的pGK1.1载体图谱；图4为本专利技术质粒酶切和PCR检测电泳图；其中，a代表质粒酶切电泳图，a中泳道1是原质粒对照，M为marker，泳道2-4为切开的载体；b代表PCR检测电泳图，b中M为marker，1-6为构建的载体样本扩增的片段；图5为本专利技术Cruiser酶切电泳图；其中，M代表marker，1-25代表克隆样本；图6为本专利技术阳性细胞株测序结果；图7为本专利技术敲击因细胞TRPV1蛋白表达量；图8为本专利技术Caco-2（WT）和Caco-2(KO)两种细胞的生长曲线；图9为本专利技术Caco-2（WT）和Caco-2(KO)两种细胞的形态。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，借此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1TRPV1基因敲除的人结直肠腺癌细胞系的构建1、实验方法（1）嘌呤毒素（Puro）对细胞的最小全致死浓度测定用胰酶消化Caco-2细胞，制备得到Caco-2细胞悬液，对Caco-2细胞悬液进行计数，24孔板每孔接种50000个细胞，每孔500μL，待细胞贴壁后向其中加入0、0.5、0.75、1、2、4μg/mL不同浓度的Puro，2-3天后镜下观察细胞，选择对细胞全致死的最低浓度作为后续实验的药物筛选浓度。（2）单克隆生长验证试验用胰酶消化Caco-2细胞，制备得到Caco-2细胞悬液，取Caco-2细胞悬液，计数后进行有限稀释，使最终96孔板中每孔细胞数为1个，将稀释后的细胞于37℃，5%CO2培养箱中静置培养；7-10天后镜下观察细胞是否有增殖趋势且能形成细胞簇。（3）电转条件筛选用胰酶消化Caco-2细胞，制备得到Caco-2细胞悬液，取100μL细胞悬液放入细胞活力检测仪器测定细胞活力（活细胞率＞95%方能进行电转），取9×106个细胞悬液于无菌管中，10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株，其特征在于，命名为人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株CACO-2 KO，于2019年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO.C202024。/n

【技术特征摘要】
1.一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株，其特征在于，命名为人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株CACO-2KO，于2019年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO.C202024。


2.一种用于敲除TRPV1基因的sgRNA的识别序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。


3.一种用于构建人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株的gRNA引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示。


4.权利要求2所述的sgRNA的识别序列和/或权利要求3所述gRNA引物对在敲除TRP...

【专利技术属性】
技术研发人员：王远微，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：四川;51