动物细胞、动物细胞的制造方法及靶蛋白的制造方法技术

本发明专利技术的课题在于提供一种增殖能力及存活率得到提高的动物细胞、上述动物细胞的制造方法及使用上述动物细胞的靶蛋白的制造方法。根据本发明专利技术，提供一种具有编码靶蛋白的基因和编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因且异戊酰辅酶A脱氢酶过表达的动物细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】动物细胞、动物细胞的制造方法及靶蛋白的制造方法
本专利技术涉及一种表达靶蛋白的动物细胞。本专利技术涉及一种上述动物细胞的制造方法及使用上述动物细胞的靶蛋白的制造方法。
技术介绍
在抗体等生物药物的制造中，为了提高抗体的生产率，通常使用补料分批培养，在该补料分批培养中通过在培养液中追加添加营养而改善细胞的状态。并且，在抗体等生物药物的制造中，为了提高抗体的生产率，通常使用灌注培养，在该灌注培养中将培养液连续过滤及排出，同时将包含营养成分的新鲜培养基连续供给到培养槽中。作为降低细胞的增殖性、存活性的废物，可以举出有机酸。其中抑制性特别高的异戊酸是通过亮氨酸的代谢而作为中间产物产生的有机酸，一般作为产生臭气的物质而为人所知。在亮氨酸的代谢途径中，亮氨酸在细胞内被酶促转化为异戊酰辅酶A(3-甲基丁酰辅酶A)。异戊酰辅酶A通过其下游酶异戊酰辅酶A脱氢酶(也缩写为IVD)被转化为3-甲基丁-2-酰辅酶A。若IVD活性降低或缺失，则中间体异戊酰辅酶A被非酶降解而产生异戊酸(图1)。在遗传上IVD基因突变或缺失的患者会积聚异戊酸，引起颅神经病症(异戊酸血症)。在非专利文献1中记载有如下：在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，从细胞分泌的异戊酸对增殖抑制起作用。在非专利文献1中，通过使用低亮氨酸培养基实施补料分批培养来减少异戊酸的分泌量，并提高增殖性。在专利文献1中记载有如下：通过将异戊酰辅酶A脱氢酶基因导入微生物来减少异戊酸生产量，并生产出难闻气味少的食品。在专利文献2中记载有在减少了亮氨酸的培养基中培养CHO细胞。现有技术文献非专利文献非专利文献1：Biotechnologyandbioengineering，vol114，2017，1779-1790专利文献专利文献1：日本特开2006-174786号公报专利文献2：WO2017051347A
技术实现思路
专利技术要解决的技术课题在补料分批培养中，与未追加添加营养的情况相比，能够长期间且高浓度培养细胞，但存在由于从细胞分泌的废物积聚而在培养后半期存活性降低的问题。并且，为了在灌注培养法中以高密度进行培养，除了供给营养以外，还将废物排出到系统外，因此需要在每天更换培养体积的1～3倍量的培养基的同时进行培养，因此成本增加成为问题。本专利技术要解决的课题在于提供一种增殖能力及存活率得到提高的动物细胞。本专利技术要解决的课题还在于提供一种上述动物细胞的制造方法及使用上述动物细胞的靶蛋白的制造方法。用于解决技术课题的手段本专利技术人为了解决上述课题而进行了深入研究，其结果发现了，通过在CHO细胞中强制表达编码促进异戊酸代谢途径的下游反应的酶即异戊酰辅酶A脱氢酶的基因，能够减少异戊酸及丁酸的生产。并且，本专利技术人等证实了，作为上述结果，细胞的状态得到改善，并且增殖性及存活性得到提高。本专利技术是根据上述见解而完成的。即，根据本专利技术，提供以下专利技术。＜1＞一种动物细胞，其具有编码靶蛋白的基因和编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因且异戊酰辅酶A脱氢酶过表达。＜2＞根据＜1＞所述的动物细胞，其中，编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因与启动子连接。＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的动物细胞，其中，动物细胞为CHO细胞。＜4＞根据＜1＞至＜3＞中任一项所述的动物细胞，其中，异戊酰辅酶A脱氢酶的表达量相对于不具有编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因的上述动物细胞为3倍以上。＜5＞根据＜1＞至＜4＞中任一项所述的动物细胞，其中，编码靶蛋白的基因和编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因存在于同一表达载体上。＜6＞一种＜1＞至＜5＞中任一项所述的动物细胞的制造方法，其包括如下工序：对动物细胞导入编码靶蛋白的基因和编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因。＜7＞根据＜6＞所述的方法，其中，导入编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因的工序通过电穿孔来进行。＜8＞根据＜6＞或＜7＞所述的方法，其中，使用包含编码靶蛋白的基因和编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因的同一表达载体来导入编码靶蛋白的基因和编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因。＜9＞一种靶蛋白的制造方法，其包括如下步骤：培养＜1＞至＜5＞中任一项所述的动物细胞。＜10＞根据＜9＞所述的方法，其中，动物细胞的培养为补料分批培养或分批培养。＜11＞根据＜10＞所述的方法，其中，细胞培养的接种细胞密度为0.2×106cells/mL以上且5×106cells/mL以下。＜12＞根据＜10＞或＜11＞所述的方法，其中，培养期间中的活细胞率在整个期间为60％以上。＜13＞根据＜10＞至＜12＞中任一项所述的方法，其中，通过了培养期间的培养液中的异戊酸的最大浓度为3000μmol/L以下。＜14＞根据＜10＞至＜13＞中任一项所述的方法，其中，通过了培养期间的每个细胞的异戊酸分泌量为30fmol/细胞/天以下。＜15＞根据＜10＞至＜14＞中任一项所述的方法，其中，通过了培养期间的培养液中的丁酸的最大浓度为3000μmol/L以下。＜16＞根据＜10＞至＜15＞中任一项所述的方法，其中，通过了培养期间的每个细胞的丁酸分泌量为30fmol/细胞/天以下。＜17＞根据＜9＞所述的方法，其中，动物细胞的培养为灌注培养。＜18＞根据＜17＞所述的方法，其中，细胞培养的接种细胞密度为0.2×106cells/mL以上且3×107cells/mL以下。＜19＞根据＜17＞或＜18＞所述的方法，其中，培养期间中的活细胞率在整个期间为90％以上。＜20＞根据＜17＞至＜19＞中任一项所述的方法，其中，培养液中的异戊酸的浓度为3000μmol/L以下。＜21＞根据＜17＞至＜20＞中任一项所述的方法，其中，每个细胞的异戊酸分泌量为30fmol/细胞/天以下。＜22＞根据＜17＞至＜21＞中任一项所述的方法，其中，通过了培养期间的培养液中的丁酸的浓度为3000μmol/L以下。＜23＞根据＜17＞至＜22＞中任一项所述的方法，其中，通过了培养期间的每个细胞的丁酸分泌量为30fmol/细胞/天以下。专利技术效果本专利技术的动物细胞具有高增殖能力及高存活率。根据本专利技术的动物细胞，能够以高生产率制造靶蛋白。附图说明图1表示细胞中的亮氨酸的代谢途径。chIvd表示CHO细胞内源性异戊酰辅酶A脱氢酶，hIVD表示外源人异戊酰辅酶A脱氢酶。图2表示包含编码与绿色荧光蛋白(GFP)缀合的人异戊酰辅酶A脱氢酶的基因hIVD-GFP的载体(pCMV6-AC-GFP)的示意图。在pCMV6-AC-GFP中，在GFP的上游的限制性酶部位编入有编码人异戊酰辅酶A脱氢酶的基因hIVD。图3表示pCMV6-Entry载体的示意图。图4表示测定基因导入后的细胞的荧光并测定发出荧光信号的细胞的比例的结果。图5表示对基因导入后的细胞确认了IVD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种动物细胞，其具有编码靶蛋白的基因和编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因且异戊酰辅酶A脱氢酶过表达。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171211 JP 2017-2366411.一种动物细胞，其具有编码靶蛋白的基因和编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因且异戊酰辅酶A脱氢酶过表达。


2.根据权利要求1所述的动物细胞，其中，
编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因与启动子连接。


3.根据权利要求1或2所述的动物细胞，其中，
动物细胞为CHO细胞。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的动物细胞，其中，
异戊酰辅酶A脱氢酶的表达量相对于不具有编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因的所述动物细胞为3倍以上。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的动物细胞，其中，
编码靶蛋白的基因和编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因存在于同一表达载体上。


6.一种权利要求1至5中任一项所述的动物细胞的制造方法，其包括如下工序：
对动物细胞导入编码靶蛋白的基因和编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因。


7.根据权利要求6所述的方法，其中，
导入编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因的工序通过电穿孔来进行。


8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，
使用包含编码靶蛋白的基因和编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因的同一表达载体来导入编码靶蛋白的基因和编码异戊酰辅酶A脱氢酶的外源基因。


9.一种靶蛋白的制造方法，其包括如下步骤：
培养权利要求1至5中任一项所述的动物细胞。


10.根据权利要求9所述的方法，其中，
动物细胞的培养为补料分批培养或分批培养。


11.根据权利要求10所述的方法，其中，
细胞培养的接种细胞密度为0.2×106cells/mL以上且5×106cells/mL以下。


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【专利技术属性】
技术研发人员：松浦达也，石原司，
申请(专利权)人：富士胶片株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP