一种Tpl2缺陷型MDCK细胞株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种Tpl2缺陷型MDCK细胞株及其构建方法和应用，涉及生物技术领域，所述MDCK细胞株中Tpl2基因第1外显子第239位～第243位碱基缺失。本发明专利技术通过移码突变敲除MDCK细胞株中的Tpl2基因，但该突变对MDCK细胞传代10代后的生长速度和细胞形态无影响；试验表明，本发明专利技术提供的Tpl2缺陷型MDCK细胞株可稳定遗传，安全可靠，克服了现有突变MDCK细胞遗传不稳定或不安全的问题。本发明专利技术所述Tpl2缺陷型MDCK细胞株接种流感病毒后可用于提高流感病毒产率，相对于常规MDCK细胞培养的上清血凝效价和上清病毒TCID

【技术实现步骤摘要】
一种Tpl2缺陷型MDCK细胞株及其构建方法和应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种Tpl2缺陷型MDCK细胞株及其构建方法和应用。
技术介绍
流感病毒(AIV)属于正粘病毒科，流感病毒属，是一种人兽共患的RNA病毒，其表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)分别有16种和9种。在世界范围内给养殖业造成了巨大的经济损失，同时给人类健康带来严重的威胁。疫苗接种是预防病毒感染最有效的策略之一。传统流感疫苗通过鸡胚接种的方式生产，在世界范围内已广泛应用，其安全性已得到了公众的认可。但这种技术仍存在一定的局限性，如鸡胚制备周期长，在流感大流行的情况下很难在短时间用鸡胚生产出所需的疫苗，及鸡胚是开放性生产系统，易于污染等。MDCK细胞是进行流感研究最常用的细胞，也是目前生产流感病毒疫苗的细胞系之一。与传统的鸡胚生产系统相比，临床分离的毒株能在MDCK细胞上生长良好，且MDCK细胞生产的流感灭活疫苗可以诱导产生更高的血凝抑制活性和中和抗体效价(BarrettPN,MundtW,KistnerO,etal.Verocellplatforminvaccineproduction:movingtowardscellculture-basedviralvaccines[J].ExpertReviewofVaccines,2009,8(5):607-618)，同时MDCK细胞生产系统，具有细胞可建库并可进行全面的细胞库检测、在封闭的生物反应器系统生产可减少外源因子污染、疫苗制备周期短等优势。因此利用MDCK细胞生产疫苗可以有效缓解流感季节流感疫苗供应量不足的问题，同时可提高疫苗的免疫原性，减少鸡蛋引起的过敏反应。细胞的免疫应答可以抑制病毒复制，而使抗原的表达量降低，因此可以通过降低细胞免疫应答的能力来促进病毒的复制。因此Hamamoto等设想，如果利用RNA干扰技术来抑制与干扰素通路有关的功能基因，有可能提高流感疫苗在MDCK细胞中的增殖滴度。作者利用siRNA敲低IRF7(可以调节Ⅰ型干扰素基因和干扰素刺激基因的转录)的表达可以将流感疫苗的产量提高3～4倍，而用shRNA敲低IRF7能够将产量提高2～8倍(HamamotoI,TakakuH,TashiroM,etal.HighYieldProductionofInfluenzaVirusinMadinDarbyCanineKidney(MDCK)CellswithStableKnockdownofIRF7[J].PlosOne,2013,8(3):e59892)。刘爱玲等利用miRNA敲低了IFNAR1的表达可以将流感病毒的产量提高4～5倍(LiuAL,LiYF,QiW,etal.Comparativeanalysisofselectedinnateimmune-relatedgenesfollowinginfectionofimmortalDF-1cellswithhighlypathogenic(H5N1)andlowpathogenic(H9N2)avianinfluenzaviruses[J].VirusGenes,2015,50(2):189-199.)。研究报道降低干扰素应答所用的方法是使用RNAi，该技术存在不能完全敲除、脱靶严重等缺陷。
技术实现思路
本专利技术针对现有的MDCK细胞的改造无法获得稳定、安全的禽流感病毒高产细胞系的问题，提供了一种Tpl2缺陷型MDCK细胞株及其构建方法，所述Tpl2缺陷型MDCK细胞株通过移码突变缺失5bp碱基而敲除了Tpl2基因，可稳定遗传，不具有致瘤性，安全可靠。本专利技术还提供了所述Tpl2缺陷型MDCK细胞株在提高流感病毒产率中的应用，本专利技术通过敲除MDCK细胞中的Tpl2基因有效抑制了细胞内的免疫应答，用于培养流感病毒时可显著提高病毒滴度。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种Tpl2缺陷型MDCK细胞株，所述MDCK细胞株中Tpl2基因第1外显子中第239位～第243位碱基缺失。本专利技术还提供了一种构建上述技术方案所述Tpl2缺陷型MDCK细胞株的方法，包括以下步骤：(1)将向导引物上下游引物序列单链混合后退火形成双链，得到向导引物双链；所述向导引物的上游引物序列如SEQIDNO.1所示，下游引物序列如SEQIDNO.2所示；(2)以BbsⅠ酶且pUC19质粒，得到线性化pUC19质粒；.(3)将线性化pUC19质粒与向导引物双链连接，得到pUC19-sgRNA质粒载体；(4)以pUC19-sgRNA和pCas9-EGFP共转染MDCK细胞，36～48h后分选表达EGFP的单个细胞进行培养7d，以靶位点鉴定引物筛选碱基数缺失的转染后MDCK细胞，即得Tpl2缺陷型MDCK细胞株；所述靶位点鉴定引物的上游引物序列如SEQIDNO.3所示，下游引物序列如SEQIDNO.4所示。优选的，步骤(1)中，所述退火形成双链的PCR反应程序为：37℃30min，95℃5min，1℃/s的速率降温至25℃。优选的，步骤(3)中，所述连接的反应体系以每10μL总体系计，包括以下试剂：100ng/μL的线性化pUC19-sgRNA质粒1μL、0.1μM的向导引物双链1μL、T4DNA连接酶1μL、10x连接酶Buffer1μL和余量的水。优选的，步骤(3)中，所述连接的反应温度为4℃，连接的反应时间为10～16h。本专利技术还提供了前述技术方案所述Tpl2缺陷型MDCK细胞株或上述技术方案所述方法制备得到的Tpl2缺陷型MDCK细胞株在提高流感病毒产率中的应用。优选的，所述流感病毒为禽流感病毒。优选的，所述禽流感病毒为H5N1亚型禽流感病毒。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种Tpl2缺陷型MDCK细胞株，所述MDCK细胞株中Tpl2基因第1外显子中第239位～第243位碱基缺失。本专利技术通过移码突变敲除了MDCK细胞株中的Tpl2基因，但是该突变对MDCK细胞传代10代后的生长速度和细胞形态没有影响；通过内、外源因子检测表明，本专利技术所述Tpl2缺陷型MDCK细胞株不受细菌、真菌和支原体污染；细胞培养直接观察和血吸附试验结果显示，本专利技术所述Tpl2缺陷型MDCK细胞株的细胞形态正常，接种鼠后动物存活率100％，并且无致畸性。可见，本专利技术提供的Tpl2缺陷型MDCK细胞株可稳定遗传，安全可靠，不影响MDCK细胞原有的生长速度和细胞形态，克服了现有突变MDCK细胞遗传不稳定或不安全的问题。本专利技术所述Tpl2缺陷型MDCK细胞株接种流感病毒后，培养得到的上清血凝效价相对于常规MDCK细胞有显著提高，培养所得上清病毒TCID50滴度也相对于MDCK细胞有显著提高，表明将本专利技术所述Tpl2缺陷型MDCK细胞株可用于提高流感病毒产率，克服了现有MDCK细胞培养流感病毒的产量不足的问题。附图说明图1为实施例1中Tpl2sgRNA测序结果；其中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Tpl2缺陷型MDCK细胞株，其特征在于，MDCK细胞株中Tpl2基因第1外显子中第239位～第243位碱基缺失。/n

【技术特征摘要】
1.一种Tpl2缺陷型MDCK细胞株，其特征在于，MDCK细胞株中Tpl2基因第1外显子中第239位～第243位碱基缺失。


2.构建权利要求1所述Tpl2缺陷型MDCK细胞株的方法，包括以下步骤：
(1)将向导引物上下游引物序列单链混合后退火形成双链，得到向导引物双链；
所述向导引物的上游引物序列如SEQIDNO.1所示，下游引物序列如SEQIDNO.2所示；
(2)以BbsⅠ酶且pUC19质粒，得到线性化pUC19质粒；.
(3)将线性化pUC19质粒与向导引物双链连接，得到pUC19-sgRNA质粒载体；
(4)以pUC19-sgRNA和pCas9-EGFP共转染MDCK细胞，36～48h后分选表达EGFP的单个细胞进行培养7d，以靶位点鉴定引物筛选碱基数缺失的转染后MDCK细胞，即得Tpl2缺陷型MDCK细胞株；
所述靶位点鉴定引物的上游引物序列如SEQIDNO.3所示，下游引物序列如SEQIDNO.4所示。


3.根据权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟庆文，王伟，陈洪岩，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：黑龙;23