稳定表达敲入EGFP的IFNGR2基因黑色素瘤B-16细胞系的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种稳定表达敲入EGFP的IFNGR2基因黑色素瘤B‑16细胞系的构建方法。本发明专利技术将绿色荧光蛋白EGFP基因序列敲入到细胞内IFNGR2基因的最后一个外显子末端，使其和IFNGR2基因融合表达。结果表明，EGFP的荧光强度与IFNGR2表达量成正相关可指示IFNGR2的表达水平，提示该细胞系可用于IFNGR2的表达调控研究。本发明专利技术为发现IFNGR2的表达调控因子和靶向肿瘤免疫的药物筛选提供有力工具。

【技术实现步骤摘要】
稳定表达敲入EGFP的IFNGR2基因黑色素瘤B-16细胞系的构建方法
本专利技术涉及一种稳定表达敲入EGFP的IFNGR2基因黑色素瘤B-16细胞系的构建方法。
技术介绍
肿瘤免疫治疗是指通过激活机体免疫系统的内在能力，靶向攻击肿瘤细胞，达到控制肿瘤发展和杀灭肿瘤目的的治疗方法。肿瘤免疫治疗主要包括免疫疫苗、免疫检查点抑制剂治疗、过继性免疫细胞治疗、细胞因子治疗等,其中免疫检查点抑制剂治疗以其显著的临床疗效而备受瞩目。然而目前临床试验数据显示，免疫检查点抑制剂仅对约20％的患者有效，导致治疗失败的原因和机制还未被充分阐明。IFNγ信号通路在免疫检查点抑制剂治疗中发挥重要的作用。GaoJ等发现肿瘤细胞中IFNγ信号通路的缺失导致了肿瘤细胞对药物的耐受，从而导致抗CTLA4治疗的失败。BenciJL等发现IFNγ信号通路可以调节肿瘤细胞对免疫检查点药物的敏感性。此外,JesseM.Zaretsky也报道了在黑色素瘤细胞系IFNγ信号通路相关基因表达异常，导致抗PD-1治疗失败。以上研究提示，提高肿瘤细胞对IFNγ的敏感性有可能改善本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞系的制备方法，包括如下步骤：利用CRIS-PITCh系统对B-16黑色素瘤细胞进行基因编辑，将绿色荧光蛋白EGFP的编码基因插入B-16黑色素瘤细胞中IFNGR2基因的第七外显子末端，使所述绿色荧光蛋白EGFP的编码基因与IFNGR2基因融合表达；所述CRIS-PITCh系统包括sgRNA表达盒；所述sgRNA的靶序列为如下(a1)或(a2)：/n(a1)SEQ ID NO.1自5’端第15881-15903位；/n(a2)SEQ ID NO.1自5’端第15936-15958位。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞系的制备方法，包括如下步骤：利用CRIS-PITCh系统对B-16黑色素瘤细胞进行基因编辑，将绿色荧光蛋白EGFP的编码基因插入B-16黑色素瘤细胞中IFNGR2基因的第七外显子末端，使所述绿色荧光蛋白EGFP的编码基因与IFNGR2基因融合表达；所述CRIS-PITCh系统包括sgRNA表达盒；所述sgRNA的靶序列为如下(a1)或(a2)：
(a1)SEQIDNO.1自5’端第15881-15903位；
(a2)SEQIDNO.1自5’端第15936-15958位。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述CRIS-PITCh系统包括载体甲及载体乙；所述载体甲包括Cas9表达盒、sgRNA表达盒和PITChsgRNA表达盒；所述载体乙包括供体片段和位于供体片段两端的同源臂；所述供体片段为如下(b1)或(b2)：
(b1)SEQIDNO.4自5’端第1595-2974位；
(b2)SEQIDNO.5自5’端第28-1407位。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：
位于(b1)所述的供体片段两端的同源臂为SEQIDNO.4自5’端第1567-1586位所示的上游同源臂和SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：李卫华，樊浩，周涛，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院生物医学分析中心，
类型：发明
国别省市：北京;11