一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法技术

本发明专利技术公开了一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，具体步骤包括：1)CD4

【技术实现步骤摘要】
一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法
本专利技术涉及生物化学与分子生物学领域，尤其涉及一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法。
技术介绍
肿瘤免疫治疗近年来在肿瘤治疗领域取得了诸多重要进展，包括过继性免疫治疗，非特异性免疫调节治疗，免疫检查点阻断治疗和单克隆抗体治疗等。其中，嵌合抗原受体T细胞治疗(ChimericantigenreceptorTcelltherapy，CARTcelltherapy)是目前最重要的肿瘤免疫治疗方法之一，其主要治疗流程是通过慢病毒等方式改造病人外周血中分离的T细胞，得到特异性CART细胞实现对肿瘤的特异性治疗。T细胞需要两个信号来激活，一般通过T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)识别抗原递呈细胞(Antigenpresentingcell，APC)递呈的抗原多肽以激活CD3信号通路获得第一信号，并同时通过T细胞表面的共刺激分子和APC或靶细胞上的配体结合以获得第二信号。两者共同作用激发下游级联反应使得T细胞激活和增殖并进行细胞杀伤等。鉴于第一信号会受到组织相容性复合体(MHC)限制的问题，为了摆脱这一限制，CART细胞主要通过表达嵌合抗原受体分子，直接与抗原受体结合并激活胞内信号以激活T细胞。在进行CART治疗时，需要从病人外周血中分离T细胞，并对T细胞进行体外培养以及改造。但如何改进其体外培养条件，以增加T细胞后续杀伤能力至关重要，将直接影响CART治疗效果而具有重要实际应用价值。在最近的研究中发现，在肿瘤微环境中，肿瘤细胞快速分裂并导致产生细胞凋亡与坏死的密集区域。在细胞坏死后，胞内离子释放造成肿瘤间质液(TIF)中局部离子失衡，钾离子高于血清中浓度并且抑制T细胞的效应子功能。进一步的研究显示，胞外高浓度的钾离子可通过触发T细胞饥饿反应，可限制T细胞效应子功能并且维持其干性。因此，本领域的技术人员致力于开发一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，通过优化钾离子浓度培养基代替普通培养基进行CART细胞的体外培养和改造，以加强CART细胞的激活程度以及体外杀伤能力。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何加强CART细胞的激活程度以及体外杀伤能力。为实现上述目的，本专利技术提供了一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)分离纯化CD4+和CD8+T细胞；2)制备高浓度钾离子培养基；3)T细胞的培养与改造：将50万个步骤1)获得的CD4+T细胞与50万个步骤1)获得的CD8+T细胞混合，用0.5ml高浓度钾离子培养基重悬得到细胞悬液；将细胞悬液加入24孔细胞培养板中，滴加磁珠悬液，置于37摄氏度，5％CO2培养箱，培养24小时；4)慢病毒感染；5)分离改造后的T细胞；6)改造后的T细胞扩增；7)培养9天后，当T细胞生长进入平台期时进行杀伤试验检测体外杀伤效率。进一步地，步骤1)中，具体步骤为：先进行细胞计数，然后分离纯化CD4+和CD8+T细胞。优选地，可使用细胞计数板或细胞计数仪进行细胞计数。进一步地，CD4+T细胞从人外周血PBMC中分离纯化得到。进一步地，CD8+T细胞从人外周血PBMC中分离纯化得到。进一步地，高浓度钾离子培养基中氯化钾的质量浓度为：2500～4800mg/L。进一步地，氯化钠的质量浓度为3000～6000mg/L。进一步地，步骤3)的磁珠悬液通过以下步骤制备获得：a)在200万个CD3/CD28细胞扩增磁珠，加入5倍体积高浓度钾离子培养基；b)用磁铁吸附CD3/CD28细胞扩增磁珠，除去液体完成一次洗涤，重复步骤a)和步骤b)三次后用0.5ml高浓度钾离子培养基重悬得到磁珠悬液。进一步地，步骤4)的具体为：加入装载CART基因的慢病毒并添加高浓度钾离子培养基至孔内液体满，培养3天后，吸去2ml培养上清，添加2ml新的高浓度钾离子培养基。进一步地，步骤5)具体为：培养5天后，通过吹吸将改造后的T细胞与磁珠分离，使用磁铁除去磁珠。进一步地，步骤6)具体步骤为：将T细胞置于6孔细胞培养板中，按50万T细胞每毫升添加新的高浓度钾离子培养基继续培养，培养7～8天后，按50万T细胞每毫升添加新的高浓度钾离子培养基。进一步地，步骤7)中，杀伤试验为荧光素酶靶细胞杀伤试验。技术效果：1、本专利技术中，使用了优化钾离子浓度培养基代替普通培养基进行CART细胞的体外培养和改造，可以CART细胞的激活程度更高；2、本专利技术所改造的CART细胞被激活后，体外杀伤能力更强。以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1是T细胞在不同培养条件下的生长曲线示意图；图2是T细胞感染病毒后第6天，Meso-CAR的表达检测结果示意图；图3是T细胞感染病毒后第6天，三次独立实验T细胞的感染效率示意图；图4是CD4+T和CD8+T细胞混合在不同培养条件下的扩增情况对比示意图；图5是在不同培养条件下，T细胞激活后表面PD-1的表达情况示意图；图6是在不同培养条件下PD-1表达的平均荧光强度示意图；图7是在不同条件培养下，Meso-CART细胞对不同靶细胞的杀伤效率对比示意图。具体实施方式以下参考说明书附图介绍本专利技术的多个优选实施例，使其
技术实现思路
更加清楚和便于理解。本专利技术可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本专利技术的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。本实施例使用高浓度钾离子培养基，在体外改造靶向间皮素(Mesothelin)的Meso-CAR，并用常规培养作为阴性对照。培养期间记录细胞生长曲线，CAR感染效率，CD4+/CD8+T细胞扩增情况以及细胞表面PD-1的表达。细胞进入静息状态后，将细胞与表达间皮素的靶细胞BT549和Skov3共培养进行杀伤实验，检测体外杀伤效率。本实施例具体操作如下：1、从人外周血PBMC中分离纯化CD4+/CD8+T细胞1)细胞计数；2)使用美国ThermoFisher公司CD4分离试剂盒(DynabeadsUntouchedHumanCD4TCellsKit)以及CD8分离试剂盒(DynabeadsUntouchedHumanCD8TCellsKit)，按照说明书分别纯化出CD4+T细胞和CD8+T细胞。2、制备高浓度钾离子培养基，培养基基础配方如下：本实施例中，氯化钾的质量浓度为：3400mg/L，摩尔浓度为：45.33mM；氯化钠的质量浓度为：33680mg/L，摩尔浓度为：63.45mM。3、T细胞的培养与改造1)将0.5×106CD4+T细胞与0.5×106CD8+T细胞混合，用0.5ml高浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)分离纯化CD4

【技术特征摘要】
1.一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)分离纯化CD4+和CD8+T细胞；
2)制备高浓度钾离子培养基；
3)T细胞的培养与改造：将50万个步骤1)获得的所述CD4+T细胞与50万个步骤1)获得的所述CD8+T细胞混合，用0.5ml所述高浓度钾离子培养基重悬得到细胞悬液；将所述细胞悬液加入24孔细胞培养板中，滴加磁珠悬液，置于37摄氏度，5％CO2培养箱，培养24小时；
4)慢病毒感染；
5)分离改造后的T细胞；
6)改造后的所述T细胞扩增；
7)培养9天后，当所述T细胞生长进入平台期时进行杀伤试验检测体外杀伤效率。


2.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，所述步骤1)中，具体步骤为：先进行细胞计数，然后分离纯化CD4+和CD8+T细胞，其中，可使用细胞计数板或细胞计数仪进行所述细胞计数。


3.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，所述CD4+T细胞从人外周血PBMC中分离纯化得到。


4.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，所述CD8+T细胞从人外周血PBMC中分离纯化得到。


5.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，所述高浓度钾离子培养基中氯化钾的质量浓度为：2500～48...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏芳，章崇祺，常昊宛，王欢禹，马小京，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31