靶向ERAD的化合物筛选系统及其应用技术方案

本发明专利技术涉及一种靶向ERAD的化合物筛选系统，包括载体细胞，载体细胞内表达有融合蛋白，融合蛋白包括α抗胰蛋白酶突变体和荧光蛋白(NHK)，编码α抗胰蛋白酶突变体的核苷酸序列包括SEQ ID No.1所示的序列。本发明专利技术还公开了上述药物筛选系统在制备检测靶向ERAD的化合物的制剂中的应用。本发明专利技术在载体细胞中通过α抗胰蛋白酶突变体与荧光蛋白融合的方式，构建出了靶向ERAD的化合物筛选系统，可在荧光显微镜下实时反映出内质网中异常折叠蛋白的蓄积，该系统可用于高通量筛选靶向ERAD的小分子先导化合物并进一步判断化合物作用位置。

【技术实现步骤摘要】
靶向ERAD的化合物筛选系统及其应用
本专利技术涉及靶向ERAD的化合物筛选
，尤其涉及一种靶向ERAD的化合物筛选系统及其应用。
技术介绍
肿瘤细胞的旺盛生长及翻译大量突变、过表达的蛋白，他们大部分将通过ERAD途径进行降解，降解产生的短肽将会作为肿瘤抗原被呈递到细胞表面。因此，ERAD底物的研究关系到肿瘤新生抗原的发现。因此，靶向ERAD对肿瘤细胞影响更大而成为抗肿瘤的新策略。但ERAD相关研究，从底物发现到机制探讨，目前尚采用低效又不准确的生化方法，因此，在细胞水平高通量筛选高通量筛选靶向ERAD的小分子先导化合物，不仅促进ERAD机制研究，同时为肿瘤治疗提供更多的可能性。NHK是突变形式的α抗胰蛋白酶，并将通过ERAD途径降解，目前已知，NHK的降解需Hrd1，sel1L，p97等内质网蛋白的协助。通过对GFP进行各种突变，在克服了splitGFP溶解性的问题后，splitGFP系统在细胞功能研究中得到了广泛应用。Zhong等人通过将GFP小片段融合在NHK的N段，将大片段表达于胞浆，构建出了drGFP系统，用以观测NHK从ER到胞浆的逆转运过程。该系统大大提到了ERAD逆转运机制的研究效率，但drGFP系统无法反映出异常蛋白在内质网中的蓄积程度而不利于ERAD底物的研究，另外，drGFP系统的应用需要蛋白酶体抑制剂的辅助，影响因素的增加提高了系统的不稳定性(ZhongY,FangS.Livecellimagingofproteindislocationfromtheendoplasmicreticulum.TheJournalofbiologicalchemistry,2012；287:28057-66)。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种靶向ERAD的化合物筛选系统及其应用，本专利技术在载体细胞中通过α抗胰蛋白酶突变体与荧光蛋白融合的方式，构建出了靶向ERAD的化合物筛选系统，可在荧光显微镜下实时反映出内质网中异常折叠蛋白的蓄积，该系统可用于高通量筛选靶向ERAD的小分子先导化合物并进一步判断化合物作用位置。本专利技术的一种靶向ERAD的化合物筛选系统，包括载体细胞，载体细胞内表达有融合蛋白，融合蛋白包括α抗胰蛋白酶突变体和荧光蛋白(NHK)，编码α抗胰蛋白酶突变体的核苷酸序列包括SEQIDNo.1所示的序列。进一步地，融合蛋白包括依次连接的信号肽(SP)、α抗胰蛋白酶突变体和荧光蛋白；编码信号肽的核苷酸序列包括SEQIDNo.2所示的序列；或依次连接的标签序列(FLAG)、信号肽、α抗胰蛋白酶突变体和荧光蛋白；编码标签序列的核苷酸序列包括SEQIDNo.3所示的序列；编码信号肽的核苷酸序列包括SEQIDNo.2所示的序列；或依次连接的标签序列、α抗胰蛋白酶突变体和荧光蛋白；编码标签序列的核苷酸序列包括SEQIDNo.3所示的序列；或依次连接的信号肽、α抗胰蛋白酶突变体、连接蛋白(Linker)和荧光蛋白；编码信号肽的核苷酸序列包括SEQIDNo.2所示的序列；编码连接蛋白的核苷酸序列包括SEQIDNo.4所示的序列；或依次连接的增强翻译的kozark序列、信号肽、α抗胰蛋白酶突变体和荧光蛋白；编码kozark序列的核苷酸序列包括SEQIDNo.5所示的序列；编码信号肽的核苷酸序列包括SEQIDNo.2所示的序列。进一步地，本专利技术中，NHK的序列中不含信号肽序列，而信号肽(SP)则采用α抗胰蛋白酶自身序列。进一步地，荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)，编码绿色荧光蛋白的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，其密码子经过优化，为蛋白水平稳定性更强的acGFP。优选地，本专利技术的融合蛋白由依次连接的SP-NHK-GFP组成，编码SP的核苷酸序列包括SEQIDNo.2所示的序列；编码GFP的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。进一步地，融合蛋白的表达载体为pLVX-puro表达载体。进一步地，载体细胞包括LOVO细胞。进一步地，化合物筛选系统的制备方法包括以下步骤：将载有编码融合蛋白的基因序列的表达载体与辅助质粒共同转染293细胞，转染后36-72小时(优选48小时)收集细胞上清用于感染载体细胞，感染后24-48小时(优选48小时)，弃细胞上清，继续培养细胞并筛选出稳定表达融合蛋白的细胞株。进一步地，辅助质粒为pSPAX2和pMD2G。进一步地，表达载体与pSPAX2和pMD2G的质量比为4:3:1。进一步地，293细胞为293T细胞。进一步地，转染试剂为PEI，PEI与质粒1:1质量比使用。进一步地，培养细胞时，将细胞接种于96孔板，1细胞/孔，培养两周。本专利技术还公开了上述药物筛选系统在制备检测靶向ERAD的化合物的制剂中的应用。进一步地，化合物包括靶向ERAD的小分子先导化合物。进一步地，靶向ERAD的小分子先导化合物包括倍半萜类化合物、蛋白酶体抑制剂和p97抑制剂中的一种或几种。进一步地，制剂包括检测药物、检测试剂盒或光学成像试剂。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：本专利技术在载体细胞中通过α抗胰蛋白酶突变体与荧光蛋白融合的方式，构建出了监控异常蛋白在ER中蓄积的工具，该工具作为靶向ERAD的化合物筛选系统，通过RNAi及小分子抑制剂验证了该系统的有效性，其可在荧光显微镜下实时反映出内质网中异常折叠蛋白的蓄积，该系统可用于高通量筛选靶向ERAD的小分子先导化合物并进一步判断化合物作用位置。本专利技术还公开了上述药物筛选系统的用途，为ERAD靶向药物的筛选提供了新方法。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合详细附图说明如后。附图说明图1是几种融合蛋白的结构示意图；图2图示了UPR及ERAD信号通路蛋白在六种肠癌细胞系中的表达水平；图3是荧光显微镜下LOVO中几种融合蛋白的表达情况结果；图4是LOVO中表达的几种融合蛋白的在流式细胞仪上的荧光表达水平检测结果；图5是几种融合蛋白的realtimePCR及WB检测结果；图6是siRNA敲低HCT116细胞中HRD1对SP-NHK-GFP的蛋白水平测试结果；图7是siRNA敲低LOVO细胞中HRD1对SP-NHK-GFP的蛋白水平测试结果；图8是MG132及NMS873存在下，LOVO细胞中5种融合蛋白表达水平测试结果；图9是明确药物在ERAD中的作用位点的激光共聚焦显微镜测试结果；图10是SP-NHK-GFP筛选作用于ERAD的不同化合物的测试结果；图11是不同化合物在ERAD中的作用位点的激光共聚焦显微镜测试结果；图1-11中，NC均表示空白对照；附图标记说明：1-NHK；2-SP；3-FLAG；4-Linker；5-kozark；6-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向ERAD的化合物筛选系统，其特征在于：包括载体细胞，所述载体细胞内表达有融合蛋白，所述融合蛋白包括α抗胰蛋白酶突变体和荧光蛋白，编码所述α抗胰蛋白酶突变体的核苷酸序列包括SEQ ID No.1所示的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向ERAD的化合物筛选系统，其特征在于：包括载体细胞，所述载体细胞内表达有融合蛋白，所述融合蛋白包括α抗胰蛋白酶突变体和荧光蛋白，编码所述α抗胰蛋白酶突变体的核苷酸序列包括SEQIDNo.1所示的序列。


2.根据权利要求1所述的化合物筛选系统，其特征在于：所述融合蛋白包括依次连接的信号肽、α抗胰蛋白酶突变体和荧光蛋白；编码所述信号肽的核苷酸序列包括SEQIDNo.2所示的序列；
或标签序列、信号肽、α抗胰蛋白酶突变体和荧光蛋白；编码所述标签序列的核苷酸序列包括SEQIDNo.3所示的序列；编码所述信号肽的核苷酸序列包括SEQIDNo.2所示的序列；
或标签序列、α抗胰蛋白酶突变体和荧光蛋白；编码所述标签序列的核苷酸序列包括SEQIDNo.3所示的序列；
或信号肽、α抗胰蛋白酶突变体、连接蛋白和荧光蛋白；编码所述信号肽的核苷酸序列包括SEQIDNo.2所示的序列；编码所述连接蛋白的核苷酸序列包括SEQIDNo.4所示的序列；
或增强翻译的kozark序列、信号肽、α抗胰蛋白酶突变体和荧光蛋白；编码所述kozark序列的核苷酸序列包括SEQIDNo.5所示的序列；编码所述信号肽的核苷酸序列包括SEQIDNo.2所示的序列。


3.根据权利要求1所述的化合物筛选系统，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘要甫，杨义力，
申请(专利权)人：苏州系统医学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32