一种可体内示踪的肝肿瘤细胞株及其构建方法技术

本发明专利技术提供了一种稳定携带萤火虫荧光素酶基因（FLuc）及杀稻瘟菌素‑s脱氨酶基因（BSD）的小鼠肝肿瘤细胞株hepa1‑6‑FLuc及其构建方法。采用逆转录病毒将Fluc基因导入小鼠肝肿瘤细胞hepa1‑6，稻瘟菌素筛选稳定表达FLuc基因的hepa1‑6‑FLuc细胞，该细胞具有与亲代hepa1‑6类似的形态及增殖、迁移、侵袭的生物学特性。细胞增殖后植入裸鼠体内，FLuc基因随着细胞增殖而复制，生物荧光活体成像技术检测到不断增强发光信号，可实际反映肝癌细胞的存活和增殖，hepa1‑6‑FLuc是一个建立肝癌动物模型的理想细胞，用于动态监测肿瘤的增殖、存活和转移。该方法可用于构建表达FLuc基因的其他细胞株，为细胞体内示踪提供了一种便捷的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种可体内示踪的肝肿瘤细胞株及其构建方法
本专利技术涉及细胞生物学领域，公开了一种可用于体内示踪的小鼠肝肿瘤细胞株Hepa1-6-FLuc及其构建方法。
技术介绍
肝癌原位移植瘤模型是研究肿瘤转移机制和肿瘤免疫的一个理想模型，进一步筛选抗肿瘤药物和判断疗效。传统的细胞追踪方法通常采用组织病理学技术观察活体组织或在实验终点活体标记细胞。这种方法虽然可以获得移植细胞在实验终点的信息，但无法获得细胞在体内定位、生存、迁移、激活的实时动态信息。体内细胞追踪技术可以实现对实验动物的无创监测，对肿瘤疾病的动态研究具有重要意义。常用的体内示踪技术包括放射性核素显像、磁共振成像、光学成像，活体成像等。其中，生物发光法是基于萤火虫荧光素酶（fireflyluciferase,FLuc）能催化底物（D-Luciferin）化学发光的原理，将体外表达荧光素酶的细胞株植入动物体内，与后期注射入体内的底物发生反应，利用光学系统检测光强度，间接反映出细胞数量的变化或细胞的定位，是无创性监测细胞体内示踪的一个有价值的工具。生物荧光活体成像技术具有灵敏度高、定量准确、创伤小、操作简单、直观等优点。目前，在人类生物学和疾病的动物模型中，广泛应用于干细胞移植、肿瘤转移或疾病病理生理的生物学过程等研究领域，特别是生物发光成像技术可以用于体内深部肿瘤的检测。腺病毒载体转导目的基因具有效率高、滴度高、瞬时转染在体内不与宿主细胞染色体整合等优点，使腺病毒载体在肿瘤的基因治疗研究与实践方面得以广泛运用，重组腺病毒可作为介导Fluc基因在不同动物细胞中的表达。一个成功的肝癌模型，移植的肝癌细胞应在体内快速增殖并形成肿块，然而，腺病毒介导的Fluc表达可能不会持续很长一段时间，导致Fluc-标记细胞的信号与肿瘤生长不一致，可能的原因是腺病毒不整合到宿主细胞基因组的基因，因此限制了来源于移植肿瘤细胞分裂的子代细胞在体内的追踪。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可体内示踪的肝肿瘤细胞株，本专利技术的目的是通过以下措施实现的：一种小鼠肝肿瘤细胞株Hepa1-6-FLuc，其特征在于：稳定携带萤火虫荧光素酶基因（FLuc）及杀稻瘟菌素-s脱氨酶基因（BSD）。上述小鼠肝肿瘤细胞株Hepa1-6-FLuc，其细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭能力不低于亲代Hepa1-6细胞，转代至20代以上FLuc基因表达水平下降低于5%，体内植入后随着肿瘤细胞的生长，FLuc基因稳定表达。本专利技术的另一目的是提供一种稳定携带萤火虫荧光素酶基因（FLuc）及杀稻瘟菌素-s脱氨酶基因（BSD）细胞株的构建方法，本专利技术的目的是通过以下措施实现的：一种稳定携带萤火虫荧光素酶基因（FLuc）及杀稻瘟菌素-s脱氨酶基因（BSD）细胞株的构建方法，采用逆转录病毒将萤火虫荧光素酶基因（FLuc）及杀稻瘟菌素-s脱氨酶基因（BSD）导入细胞，筛选具有稻瘟菌素抗性的细胞，检测细胞中FLuc的表达，获得稳定表达FLuc细胞株；将细胞株植入小鼠体内，活体生物发光成像技术动态检测细胞在体内的生物发光信号，用于细胞体内长时间示踪。上述细胞株构建方法，包括以下步骤：（1）逆转录病毒构建：将Fluc基因克隆至pSEB-Flag质粒，获得携带FLuc基因的pSEB-FLuc质粒。将pSEB-FLuc与pAmpho质粒共转染293细胞，获得逆转录病毒；（2）细胞构建：逆转录病毒感染目的细胞，经稻瘟菌素抗性加压筛选获得的抗稻瘟菌素的细胞；检测不同代数细胞的Luc活性；（3）细胞鉴定：以亲代细胞株为对照，检测两种细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭能力；（4）细胞体内示踪：将亲代细胞、腺病毒Ad-Fluc感染细胞及FLuc稳定细胞，移植入裸鼠皮下成瘤，分别于植入后第ld、7d、14d活体组织成像动态观察植入细胞的生长情况，比较荧光信号强度的变化趋势与同一视野白光下的细胞生长，优选的，细胞株为肿瘤细胞，测量瘤体大小并进行细胞体内成瘤模型的组织学鉴定。上述细胞株构建方法，所述pSEB-Flag载体结构如图1所示，DNA序列为SEQIDNO.1；所述pSEB-FLuc质粒结构如图2所示，DNA序列为SEQIDNO.2，所述FLuc基因的DNA序列为SEQIDNO.3，所述BSD的DNA序列为SEQIDNO.4。有益效果1.本专利技术提供了一种稳定表达Fluc基因的hepa1-6-FLuc小鼠肝癌细胞株，是一个建立肝癌动物模型的理想细胞，用于动态监测肿瘤的增殖、存活和转移，为肝癌基础研究及肝癌治疗中筛选新的抗癌药物等领域提供了一个重要的实验动物模型。2.本专利技术提供了一种稳定携带萤火虫荧光素酶基因（FLuc）及杀稻瘟菌素-s脱氨酶基因（BSD）细胞株的构建方法。将FLuc及BSD基因通过逆转录病毒的方式稳定导入细胞内，通过稻瘟菌素方便快捷地筛选出稳定表达FLuc基因的细胞，该细胞与亲代细胞的生物学性状无差异，并且体内生物荧光活体示踪可动态真实地反映细胞在体内的存活及增殖情况。该制备方法可用于构建表达FLuc基因的其他细胞株，为细胞体内示踪提供了一种便捷的方法。附图说明图1是pSEB-Flag质粒结构图图2是pSEB-FLuc质粒结构图图3是稻瘟菌素筛选hepa1-6-FLuc细胞形态图（a.hepa1-6细胞经稻瘟菌素筛选10天;b.hepa1-6-FLuc细胞经稻瘟菌素筛选10天;c.亲代hepa1-6细胞；d.第10代hepa1-6-FLuc细胞)图4是不同代数hepa1-6-FLuc细胞的Luc活性检测图图5是hepa1-6-FLuc细胞及亲代hepa1-6细胞的增殖曲线图（A.MTT检测增殖曲线；B.不同培养天数的结晶紫染色；C.B图孔板中结晶紫溶解后比色）图6是细胞克隆形成及克隆形成率图7是划痕实验检测细胞平行迁移能力图8是Transwell检测细胞垂直迁移能力(上图)及侵袭能力(下图)图9是体内细胞示踪的生物发光信号图图10是裸鼠皮下肿瘤体积图11是肝癌组织病理学检测(H.E染色)具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行具体描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本专利技术进行进一步的说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述
技术实现思路
对本专利技术做出一些非本质的改进和调整。一、逆转录病毒构建将FLuc基因插入至pSEB-Flag逆转录病毒质粒（图1）的多克隆区域（BglⅡ和SalⅠ之间）获得携带FLuc基因及BSD基因的pSEB-FLuc质粒（图2）和pAmpho逆转录病毒包膜质粒共转染HEK293细胞获得逆转录病毒。二、携带Fluc基因的小鼠肝癌细胞株hepa1-6-FLuc的构建，筛选及生物学性状鉴定1.细胞构建：逆转录病毒感染细胞，经稻瘟菌素3μg/ml抗性加压筛选，10天后有10%的细胞存活，而亲代hepa1-6细胞全部死亡（图3-a,b），维持稻瘟菌素3μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小鼠肝肿瘤细胞株Hepa1-6-FLuc，其特征在于：稳定携带萤火虫荧光素酶基因（FLuc）及杀稻瘟菌素-s脱氨酶基因（BSD）。/n

【技术特征摘要】
1.一种小鼠肝肿瘤细胞株Hepa1-6-FLuc，其特征在于：稳定携带萤火虫荧光素酶基因（FLuc）及杀稻瘟菌素-s脱氨酶基因（BSD）。


2.如权利要求2所述的小鼠肝肿瘤细胞株Hepa1-6-FLuc，其特征还在于：细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭能力不低于亲代Hepa1-6细胞，转代至10代以上FLuc基因表达水平下降低于5%，体内植入后随着肿瘤细胞的生长Fluc稳定表达。


3.一种如权利要求1所述细胞株的构建方法，采用逆转录病毒将萤火虫荧光素酶基因（FLuc）及杀稻瘟菌素-s脱氨酶基因（BSD）导入细胞，筛选具有稻瘟菌素抗性的细胞，检测细胞中FLuc的表达，获得稳定表达FLuc细胞株；将细胞株植入小鼠体内，活体生物发光成像技术动态检测细胞在体内的生物发光信号，用于细胞体内长时间示踪。


4.如权利要求3所述的细胞株构建方法，包括以下步骤：
（1）逆转录病毒构建：将Fluc基因克隆至pSEB-Flag质粒，获得携带FLu...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕杨，张楠楠，何昀，李娅莎，赵丽，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属儿童医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50