苏云金芽孢杆菌Cry2A毒素的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种用于Bt Cry2A毒素检测的抗体制备方法及其应用，该抗体是通过免疫Balb/c小鼠后，获得保藏号为CCTCC NO：C2019188杂交瘤细胞分泌产生；本申请同时提供了基于此抗体建立DAS‑ELISA检测方法，该方法最低检测限为10.76ng/ml，对基于50μg/ml的Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1F毒素的交叉反应率小于0.1％，与Cry1B毒素的交叉反应率为3.2％，特异性较强，可用于Cry2A毒素的快速检测，弥补了Cry2A毒素检测领域的空白。

【技术实现步骤摘要】
苏云金芽孢杆菌Cry2A毒素的单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及一种转基因植物中常见的苏云金芽孢杆菌Cry2A毒素的单克隆抗体及其应用，可用于制备检测转基因植物中常见的Cry2A毒素的试剂盒，属于生物

技术介绍
苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，BT)，是一种包含许多变种的产晶体芽孢杆菌，属于革兰氏阳性菌。BTCry毒素因其具有对靶标昆虫特异性高、对人畜和有益生物安全、对环境无污染等优势被广泛应用于农业生产中，但近年来转Bt基因抗虫植物的使用，人们对于它的环境生态安全和安全隐患问题的担忧逐渐增加。目前对于转Bt基因植物的检测，主要针对重组DNA和Cry毒素蛋白。目前普遍接受的用于准确和特异性检测转Bt基因植物的方法主要有PCR、实时PCR、高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)、ELISA和胶体金免疫层析试纸条等。然而，虽然PCR方法具有较高的灵敏度和特异性，但不能测定出Cry毒素的表达水平，另外耗时较长，需要由专业人员操作特定的仪器。而对于HPLC测定方法，它需要用到昂贵的仪器，花费比较高，而且需要受过培训的专业人员操作，前处理复杂，耗费时间长，不能用于快速田间检测。而免疫学检测方法，如ELISA和胶体金免疫层析试纸条，操作简单，不需要昂贵的仪器，在短时间内就可以定量或半定量的检测出目标蛋白。免疫学检测技术主要是以抗原抗体的特异性反应为基础建立起来的，抗原-抗体反应，即抗原和抗体之间的特异性反应。免疫学测定也存在竞争和非竞争两种形式。非竞争免疫检测技术是较竞争免疫技术更优越的一种模式，具有更高的特异性，更高的灵敏度和更少的抗原用量。DAS-ELISA(双夹心ELISA检测)是在BtCry毒素检测中应用最为广泛的方法，其中被分析物夹在捕获抗体和检测抗体之间。目前许多基于DAS-ELISA的检测方法都已应用到Cry毒素的检测当中，如Cry1Ab，Cry1Ac等。2015年武爱华等从噬菌体展示十二肽中筛选获得能够特异性结合Cry2A的十二肽，并基于此十二肽建立了检测Cry2A毒素的间接竞争ELISA方法。然而由于共性结构的存在，对于某种Bt毒素检测的单克隆抗体对其他毒素具有一定的交叉反应。(Rodaet.Developmentandvalidationofasensitiveandfastchemiluminescentenzymeimmunoassayforthedetectionofgeneticallymodifiedmaize,2006；Zhangrtai.Rapidisolationofsingle-chainantibodiesfromahumansyntheticphagedisplaylibraryfordetectionofBacillusthuringiensis(Bt)Cry1Btoxin,2012)。目前，已存在Cry1A类检测方法(Dongsaetal.ProductionandCharacterizationofMonoclonalAntibodyBroadlyRecognizingCry1ToxinsbyUseofDesignedPolypeptideasHapten，2016)，但针对Cry2A毒素的单克隆抗体检测方法尚未见报道。
技术实现思路
针对上述Cry2A毒素检测耗时长、存在交叉反应的问题，本申请提供一种苏云金芽孢杆菌Cry2A毒素单克隆抗体，并利用该Cry2A单克隆抗体进行DAS-ELISA检测，交叉反应率低，并基于包被完成的前提下，可在4-5小时内迅速检测样品中是否有Cry2A的存在，检测结果呈现明显的颜色变化(蓝色)，实现Cry2A毒素的快速准确检测，节省时间。本申请采用如下技术方案实现的：本申请首先提供了一种苏云金芽孢杆菌Cry2A单克隆抗体杂交瘤细胞株1D2D11，该细胞株1D2D11保藏号为CCTCCNO：C2019188，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉，邮编：430072，保藏名称为：杂交瘤细胞株1D2D11，保藏时间为2019年10月30日。其次，本申请还提供了由保藏号为CCTCCNO：C2019188的杂交瘤细胞株1D2D11制备的苏云金芽孢杆菌Cry2A单克隆抗体。第三，本申请提供了由保藏号为CCTCCNO：C2019188的杂交瘤细胞株1D2D11制备的苏云金芽孢杆菌Cry2A单克隆抗体的应用，即利用该单克隆抗体建立的针对BtCry2A的DAS-ELISA非竞争性检测方法，可以用于实验室或田间检测农作物叶片中是否带有/残留BtCry2A基因的检测，该方法突破了非竞争性检测中共性结构的交叉反应现象，可特异性的针对BtCry2A毒素浓度在0.010763-4μg/ml范围内的样品进行检测；该检测方法具体步骤如下：(1)包被捕获抗体：将Cry2A毒素多克隆抗体(制备方法参见“犬降钙素原蛋白多克隆抗体制备及应用分析”，王栋，《山东农业大学》2019硕士论文”)用PBS缓冲液稀释到0.5μg/ml，加入到96孔酶标板中，100μl/孔，4℃过夜；(2)封闭：次日PBST洗板3次。每孔加入200μl的浓度为5％的MPBS，37℃孵育1h；(3)加样品：PBST洗板三次，将待测样品在CBS缓冲液中2倍倍比稀释后加到孔内，100μl/孔，同时用CBS作为空白对照，37℃孵育1h；(4)加待测抗体：PBST洗板三次，孔内加入0.5μg/ml的保藏号为CCTCCNO：C2019188的杂交瘤细胞株1D2D11分泌的Cry2A单克隆抗体注射小鼠后所收集的腹水纯化后的抗体(100μl/孔)，置于37℃培养箱孵育1h；(5)加酶标抗体：PBST洗板3次，每孔加入100μlHRP标记的羊抗鼠抗体(1：5000)，置于37℃培养箱孵育1h；(6)显色：PBST洗板5次，将TMB显色液加入到酶标板微孔内，100μl/孔，并置于37℃培养箱孵育15min；在0.010763-4μg/ml的范围内可检测出样品是否含有Cry2A毒素，样品呈现蓝色变化。第四，本申请提供了一种用于检测BtCry2A的DAS-ELISA试剂盒，该试剂盒包括由保藏号为CCTCCNO：C2019188的杂交瘤细胞株1D2D11分泌苏云金芽孢杆菌Cry2A单克隆抗体。本专利技术针对转基因植物中常见的BtCry2A基因，选择原毒素作为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，经细胞融合、亚克隆筛选，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株，与现有苏云金芽孢杆菌Cry2A检测方法相比，本专利技术的优点及有益效果如下：(1)本专利技术获得的杂交瘤细胞株1D2D11,保藏号为CCTCCNO：C2019188分泌的单克隆抗体，能特异性识别BtCry2A，具有检测转基因BtCry2A蛋白的特性。(2)本专利技术获得的杂交瘤细胞株1D2D11，保藏号为CCTCCNO：C2019188分泌的单克隆抗体建立的DAS-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种苏云金芽孢杆菌Cry2A单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞保藏号为CCTCC NO：C2019188。/n

【技术特征摘要】
1.一种苏云金芽孢杆菌Cry2A单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞保藏号为CCTCCNO：C2019188。


2.如权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌获得的苏云金芽孢杆菌Cry2A单克隆抗体。


3.如权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌获得的苏云金芽孢杆菌Cry2A单克隆抗体在Cry2A毒素检测中的应用。


4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，具体步骤如下：
将Cry2A毒素多克隆抗体用PBS缓冲液稀释到0.5µg/ml，加入到酶标板中，100µl/孔，4℃过夜；次日PBST洗板，加入MPBS，孵育1h；PBST洗板后，CBS缓冲液将待测样品稀释后加到酶标板中，100µl/孔，同时...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘贤金，李懿航，范荣荣，刘媛，郝佳，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32