分泌番茄斑驳花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用制造技术

本发明专利技术公开了一种分泌抗番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus，ToMMV)单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用。以提纯的ToMMV病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能分泌抗ToMMV单抗的杂交瘤细胞株2D6，其保藏号为CGMMC NO.18846。该细胞株分泌单抗腹水间接ELISA效价达10

Hybridoma cell line secreting monoclonal antibody of tomato mottle mosaic virus and its application

【技术实现步骤摘要】
分泌番茄斑驳花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种分泌番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
技术介绍
番茄斑驳花叶病毒(ToMMV)是帚状病毒科(Viraviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的一个新种，基因组为正义单链RNA。ToMMV的基因组包含四个开放阅读框，与烟草花叶病毒一样，它表达四种蛋白质，编码1个126kD和1个183kD复制需要的蛋白，还编码1个30kD的运动蛋白和1个17.5kD的外壳蛋白。2013年该新病毒在墨西哥番茄上首次被发现，随后在美国、以色列、巴西、西班牙等地的番茄上检出该病毒，我国云南省与海南省的番茄也受到该病毒的侵染。ToMMV可危害多种茄科作物，所致病害症状主要表现为植株矮化、叶片褪绿斑驳扭曲，引起严重的产品损失。该病毒具较高的稳定性，可在病残体中存活较长时间，并可附着在种表或以病残体混杂在种子中实现远距离传播，易经机械摩擦在植株间传染。我国主要茄科作物，如番茄、辣椒、烟草等多采用育苗移栽的方式栽培，部分番茄(如圣女果)还采用嫁接育苗，加之田间管理过程中需经多次打杈、整枝、上架及采果等操作，因此，该病毒一旦传入极易扩散流行。关于该病毒的发生规律、传播途径、病毒检测技术及病毒基因组功能的研究甚少。为了调查我国多种茄科植物的该病害的发生情况、强化我国ToMMV检测和诊断技术及科学指导防控，急需建立检测ToMMV经济有效、高通量的实用检测技术。与常规的指示植物接种、电镜观察、分子检测等方法相比，血清学方法具有简单、经济、易操作、可大规模检测等优点，是植物病毒检测和调查最实用的方法。但血清学的方法的建立依赖于特异性高质量的病毒抗体。本专利技术以纯化的ToMMV病毒粒子作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌ToMMV特异性单抗的杂交瘤细胞株，以分泌的单抗为核心建立检测ToMMV的高通量的血清学方法及试剂盒，从而为我国ToMMV的检测诊断、流行病学的调查、病毒基因组功能分析、组培生产、抗性育种、科学防控建立等提供物质和技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗番茄斑驳花叶病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。分泌番茄斑驳花叶病毒单抗的杂交瘤细胞株2D6，它能特异性分泌抗番茄斑驳花叶病毒的单抗，杂交瘤细胞株2D6于2019年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMMCNO.18846。一种所述的杂交瘤细胞分泌的番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体，抗ToMMV病毒单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-8，抗体类型及亚类为IgG2a、κ轻链，与番茄斑驳花叶病毒17.5kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立的ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测感染ToMMV番茄病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:40,960和1:20,480倍稀释(w/v,g/mL)。抗番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体能与番茄斑驳花叶病毒有特异性免疫反应，而不与感染烟草花叶病毒、番茄花叶病毒、感染番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄黑环病毒、黄瓜花叶病毒病叶和健康植物组织发生免疫反应。抗番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。本专利技术与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株能分泌大量抗番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体，以该单抗为核心建立的ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissueprint-ELISA血清学检测方法及其免疫学试剂盒能高度特异、灵敏、准确地检测番茄斑驳花叶病毒；2)利用本专利技术所制备的单克隆抗体检测番茄斑驳花叶病毒，对操作人员的技术要求低，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本专利技术所制备的单克隆抗体可有效地用于田间番茄斑驳花叶病毒的检测诊断，也可用于该病毒病的流行病学调查、病毒基因组功能分析、抗性育种、科学防控等方面。附图说明图1为dot-ELISA方法检测ToMMV的灵敏度分析；图2为ACP-ELISA(A)、dot-ELISA(B)和Tissueprint-ELISA(C)和RT-PCR(D)检测田间番茄样品中ToMMV结果。2D图中的M代表1kb的DNAMarker。g2和h2分别为感染ToMMV病叶阳性对照和健康番茄叶片阴性对照，其他样品为田间样品。生物保藏分泌番茄斑驳花叶病毒单抗杂交瘤细胞株2D6于2019年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMMCNO.18846。具体实施方式分泌番茄斑驳花叶病毒单抗杂交瘤细胞株2D6于2019年11月4日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMMCNO.18846，它能分泌抗番茄斑驳花叶病毒的单抗。一种所述的杂交瘤细胞分泌番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体，该单抗腹水间接ELISA效价达10-8，抗体类型及亚类为IgG2a、κ轻链，与番茄斑驳花叶病毒17.5kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立的ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测感染番茄斑驳花叶病毒的病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1∶40,960和1∶20,480倍稀释(w/v，g/mL)。抗番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体能与番茄斑驳花叶病毒有特异性免疫反应，而不与感染烟草花叶病毒、番茄花叶病毒、感染番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄黑环病毒、黄瓜花叶病毒病叶和健康植物组织发生免疫反应。抗番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。本专利技术提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗番茄斑驳花叶病毒单抗，且该细胞株分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好、灵敏度高。以该单抗为核心建立检测ToMMV的高通量的血清学方法可成功应用于田间ToMMV的检测诊断，从而为我国ToMMV病检测和诊断、组培的生产、科学防控提供物质和技术支持。下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步说明。一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备1.免疫原及检测抗原的制备用以下操作步骤提纯病毒粒子：1)将组织匀浆器在冰上预冷；2)称取感染ToMMV的番茄病叶组织200g，加入400mL0.5M磷酸盐缓冲液即PB缓冲液(含0.01MNa-EDTA和0.1％巯基乙醇，pH7.5)，在组织匀浆器中匀浆5-10min使植物组织充分匀浆，用双层棉纱布过滤匀浆液，滤液6,000rpm离心20min去除植物残渣；3)所得的上清液在搅拌中加至终浓度为2.5％TritonX-100、4％PEG(分子量为6,000)和0.1MNaCl，然后4℃搅拌过夜；4)11,000rpm离心15min后去上清；5)用pH7.5的0.5MPB(含0.01MMgCl本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分泌番茄斑驳花叶病毒单抗杂交瘤细胞株2D6，其特征在于能分泌抗番茄斑驳花叶病毒单抗，所述的杂交瘤细胞株2D6于2019年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMMC NO.18846。/n

【技术特征摘要】
1.一种分泌番茄斑驳花叶病毒单抗杂交瘤细胞株2D6，其特征在于能分泌抗番茄斑驳花叶病毒单抗，所述的杂交瘤细胞株2D6于2019年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMMCNO.18846。


2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株2D6分泌的番茄斑驳花叶病毒单抗，其特征在于该单抗腹水间接ELISA效价达10-8，抗体类型及亚类为IgG2a、κ轻链，该单抗与番茄斑驳花叶病毒17.5kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测感染ToM...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建祥，郭丽倩，吴佳瑜，钱亚娟，周雪平，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33