一株泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM 8G3及其应用制造技术

一株泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM 8G3及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明专利技术泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM 8G3已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18519。首先合成泛酸半抗原，再制备泛酸完全抗原，并将它免疫BALB/c小鼠，取高效价、低IC

A pantothenic acid monoclonal antibody hybridoma cell line sm8g3 and its application

【技术实现步骤摘要】
一株泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM8G3及其应用
本专利技术涉及一株泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM8G3及其应用，属于食品安全免疫检测

技术介绍
泛酸属于B族维生素，也称为维生素B5，在体内转变成辅酶A或者酰基载体蛋白，参与糖、脂肪、蛋白质和能量代谢。泛酸是神经和大脑必需的营养物质，是脂肪酸合成类固醇必须物质，泛酸有助于体内类固醇的分泌，保持皮肤和头发的健康。同时，泛酸也可参与类固醇脂质、褪黑激素和亚铁血红素的合成。泛酸亦帮助细胞的形成，维持正常发育和中枢神经系统的发育。再者，泛酸具有抗体制造功能，能帮助抵抗传染病，缓和多种抗生素副作用及毒性，并有助于减轻过敏症状。泛酸缺乏时，会导致低血糖、皮肤异常、疲倦失眠、食欲不振及消化不良等症状。术后病人、营养不良、妊娠哺乳期妇女需要补充泛酸。每日推荐的泛酸摄入量为成人通常为4-7mg，妊娠妇女及哺乳期妇女为5-9mg。泛酸广泛存在于多种食品，同时也是许多食品的添加剂。因此，有必要建立快速、高效的食品中泛酸的检测方法。泛酸含量分析方法有微生物法、高效液相色谱法(HPLC)、液质联用(LC-MS)等仪器方法，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高等缺点，因此建立快速简便的泛酸检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为泛酸检测提供了一种新的检测途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM8G3及其应用，由该细胞株制备的抗体对泛酸具有较高的检测灵敏度，可以用来建立泛酸的免疫学检测方法。本专利技术的技术方案，一株泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM8G3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCCNo.18519。泛酸单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCCNo.18519的泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM8G3分泌产生。所述泛酸免疫原的合成路线如下：（1）泛酸半抗原的制备：称取4-(溴甲基)-苯乙酸苯甲酰甲基酯(化合物2)1000mg(2.89mmol),将其溶解于20mL的DMF溶液中，称取泛酸(化合物1)632mg(2.89mmol)加入到该溶液中，并向溶液中加入氟化钾(670mg,11.56mmol),并于室温下搅拌2h。合并有机相，并用40mL水洗涤，乙酸乙酯萃取，并经Na2SO4干燥，浓缩。得到黄色油状化合物3(1g)。化合物3（1000mg，2.06mmol）溶解于10mLCH3COOH溶液中，向其中加入锌粉，室温搅拌过夜。浓缩合并的有机相，并通过制备柱纯化得到黄色油状化合物4(250mg)，即泛酸半抗原。（2）免疫原泛酸-BSA的制备：称取1.64mg的泛酸半抗原将其溶解在800μLDMF中，然后加入2.58mgEDC，1.55mgNHS，该混合物在室温搅拌6h，得到反应液A；称取5mgBSA，溶解于0.1M硼酸盐缓冲液中，得到溶液B；随后，逐滴将反应液A液加入到溶液B液中，室温反应8h，即得偶联物泛酸-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原泛酸-BSA。本专利技术的泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM8G3的筛选方法，主要包括以下步骤：（1）小鼠的免疫：将免疫原泛酸-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用泛酸-BSA完全抗原（不含佐剂）冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制；（2）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM8G3；（3）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的细胞株SM8G3分泌的单克隆抗体，对泛酸具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50为210.85ng/mL），可实现对果蔬、谷物中泛酸残留量的检测，为食品中泛酸残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。生物材料样品保藏：一株泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM8G3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCCNo.18519。附图说明图1SM8G3单克隆抗体对泛酸的抑制标准曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将泛酸完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对泛酸有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。实施例1杂交瘤细胞株SM8G3的制备（1）完全抗原的制备：a、半抗原合成路线如下：泛酸半抗原的制备：称取4-(溴甲基)-苯乙酸苯甲酰甲基酯(化合物2)1000mg(2.89mmol),将其溶解于20mL的DMF溶液中，称取泛酸(化合物1)632mg(2.89mmol)加入到该溶液中，并向溶液中加入氟化钾(670mg,11.56mmol),并于室温下搅拌2h。合并有机相，并用40mL水洗涤，乙酸乙酯萃取，并经Na2SO4干燥，浓缩。得到黄色油状化合物3(1g)。化合物3（1000mg，2.06mmol）溶解于10mLCH3COOH溶液中，向其中加入锌粉，室温搅拌过夜。浓缩合并的有机相，并通过制备柱纯化得到黄色油状化合物4(250mg)。b、免疫原泛酸-BSA的制备：称取1.6mg泛酸半抗原，1-乙基碳二亚胺盐酸盐2.58mg，N-羟基琥珀酰亚胺1.55mg，用800μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到A1液，室温搅拌反应6h。取牛血清蛋白BSA5mg（泛酸半抗原与BSA摩尔比为60:1)，用2mL0.1M硼酸盐缓冲溶液溶解，得到B1液，在室温条件，逐滴将A1液加入到B1液中，室温反应8h，即得偶联物泛酸-BSA（60:1）混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，得到偶联物泛酸-BSA（60:1）。（2）包被原泛酸-OVA的制备：称取2.45mg泛酸半抗原，1-乙基碳二亚胺盐酸盐3.84mg，N-羟基琥珀酰亚胺2.30mg，用800μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM 8G3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18519。/n

【技术特征摘要】
1.一株泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM8G3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCCNo.18519。


2.泛酸单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.18519的泛酸单克隆抗体杂交瘤细胞株SM8G3分泌产生。


3.泛酸半抗原的合成，其特征在于步骤为：称取4-(溴甲基)-苯乙酸苯甲酰甲基酯1000mg,将其溶解于20mL的DMF溶液中；称取泛酸632mg加入到该溶液中，并向溶液中加入氟化钾670mg,并于室温下搅拌2h；合并有机相，并用40mL水洗涤，乙酸乙酯萃取，并经Na2SO4干燥，浓缩，得到黄色油状化合物；将所得化合物溶解于10mLCH3COOH...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，曾露，匡华，徐丽广，孙茂忠，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，郝昌龙，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32