两株新的大熊猫C反应蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及两株新的大熊猫C反应蛋白(CRP)单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，具体涉及大熊猫重组CRP杂交瘤细胞株的筛选，从而获得大熊猫CRP单克隆抗体，并应用于分析大熊猫血液CRP浓度。本发明专利技术通过利用细胞融合技术，获得了分泌抗大熊猫CRP单克隆抗体的杂交瘤细胞株2株(保藏编号为CCTCC NO：C2019297和CCTCC NO：C2019298)，收集并纯化细胞株培养上清，获得高效价的大熊猫CRP单克隆抗体，然后通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对大熊猫血清中CRP蛋白浓度进行检测，并建立了大熊猫血液CRP浓度检测技术体系，作为大熊猫炎症状态判断指标之一。

Two new hybridoma cell lines with monoclonal antibodies to C-reactive protein of giant panda and their application

【技术实现步骤摘要】
两株新的大熊猫C反应蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及制备两株大熊猫重组C反应蛋白(CRP)杂交瘤细胞株，从而得到高效价大熊猫CRP单克隆抗体，并应用于大熊猫血液CRP浓度测定。
技术介绍
C-反应蛋白(CRP)，在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质，可作为炎症的生物标志物。人类CRP包括200多个氨基酸，其一级结构包含5个相同的亚单位，亚单位间以非共价键相结合，每个亚单位在其表面都含有CRP配体结合位点，构成一种环状五聚体蛋白。CRP具有物种特异性，例如大熊猫CRP与人CRP的蛋白质序列只有66.99％的相似性，与狗CRP只有70.27％。我们前期实验显示，已开发的人和狗CRP检测试剂盒均无法用于大熊猫CRP浓度检测。因此需要开发大熊猫CRP单克隆抗体用于检测大熊猫的炎症状态。单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，可通过骨髓瘤细胞与B淋巴细胞进行细胞融合筛选杂交瘤细胞，并通过收集、纯化杂交瘤细胞分泌液得到单克隆抗体。本专利技术通过筛选大熊猫CRP杂交瘤细胞，得到高效价的大熊猫CRP抗体，建立特异性的大熊猫CRP抗体ELISA检测方法。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种抗大熊猫CRP亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株、抗大熊猫CRP亚基单克隆抗体及制备方法，解决现有技术中没有特异的抗大熊猫CRP特异抗体的问题。为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：第一方面，本专利技术提供了一种杂交瘤细胞株，为抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1，保藏编号为CCTCCNO：C2019297。本专利技术还提供了另一种杂交瘤细胞株，为抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_2，保藏编号为CCTCCNO：C2019298。第二方面，本专利技术保护抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1、抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_2在生产抗大熊猫CRP单克隆抗体中的应用。第三方面，本专利技术提供了一种抗大熊猫CRP单克隆抗体，是由抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1和/或抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_2产生。优选地，上述抗大熊猫CRP单克隆抗体的亚型为IgG1。第四方面，本专利技术还保护上述抗大熊猫CRP单克隆抗体在westernblot技术、ELISA技术中的应用。第五方面，本专利技术还提供了一种抗大熊猫CRP单克隆抗体的制备方法，包括步骤：培养抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1和/或抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_2，收集细胞培养上清，纯化并浓缩得到抗大熊猫CRP单克隆抗体。优选地，制备方法包括步骤：S1：根据NCBI上公布的大熊猫CRP蛋白氨基酸序列(MNHKVHHHHHHMELGTLEGSQGNTYRKAFVFPTESATSFVTLFAPVQKPLKAFTVCLQAYTDLTRPYSLFSYATRTQYNEILLFKERPGLYSVSVGGSDAYIKAPETFFAPKHFCVTWESKTGITELWVDGKAMVRTSLKKGYTVGAEASIILGQEQDSFGGRFDKNQSLLGDVGEVNMWDYVLSPDEISTVYNGGVFSPNFLNWQDLKYEIQGEVFLKNQLWP)，构建原核表达载体，通过原核表达制备大熊猫CRP重组蛋白CRP_panda，作为生产特异性抗体的免疫原；S2：将步骤S1中的免疫原和佐剂一起注射至小鼠腹腔免疫小鼠，多次免疫，直至血清效价达标为止；S3：采用常规方法进行细胞融合，得到杂交瘤细胞；S4：对步骤S3得到的杂交瘤细胞进行阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，通过有限稀释法得到抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1和/或抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_2，并进行亚型鉴定；S5：对步骤S4中所得的抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1和/或抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_2进行大量培养，收集细胞培养的上清液，纯化并浓缩得到特异性抗大熊猫CRP单克隆抗体。本专利技术提供的技术方案，具有如下的有益效果：本专利技术利用细胞融合技术，建立分泌抗CRP单克隆抗体的杂交瘤细胞株(CRP杂交瘤细胞株CRP_panda_1、CRP_panda_2)，收集并纯化细胞株培养上清，获得了高特异性CRP单克隆抗体，并通过westernblot检测抗体纯度，适合酶联免疫吸附试验(ELISA)，同时为CRP蛋白的定位和组织表达信息及利用CRP高特异性的单克隆抗体对CRP受体的配体、拮抗物、抗拮抗物进行深入研究。本专利技术采用的步骤方法简单，得到的抗体效价高，完全适合于ELISA检测方法，从而可以在短时间内得到检测结果，从而判断大熊猫的炎症状态。保藏信息：抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1，保藏编号：CCTCCNO：C2019297；抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_2，保藏编号为CCTCCNO：C2019298，均于2019年12月25日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏，地址：中国武汉武汉大学。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1为本专利技术实施例3中采用的大熊猫血清样品稀释倍数与CRP蛋白浓度标准曲线。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。实施例1本实施例提供大熊猫CRP杂交瘤细胞的制备方法，具体包括如下步骤。1、特异重组蛋白的设计与合成根据NCBI数据库大熊猫基因组中CRP氨基酸序列，序列为：MNHKVHHHHHHMELGTLEGSQGNTYRKAFVFPTESATSFVTLFAPVQKPLKAFTVCLQAYTDLTRPYSLFSYATRTQYNEILLFKERPGLYSVSVGGSDAYIKAPETFFAPKHFCVTWESKTGITELWVDGKAMVRTSLKKGYTVGAEASIILGQEQDSFGGRFDKNQSLLGDVGEVNMWDYVLSPDEISTVYNGGVFSPNFLNWQDLKYEIQGEVFLKNQLWP(SEQIDNO：1所示)，并通过原核表达得到重组蛋白，作为生产特异性抗体的免疫原(CRP_panda)，浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于：/n所述杂交瘤细胞株为抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1，保藏编号为CCTCC NO：C2019297。/n

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于：
所述杂交瘤细胞株为抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_1，保藏编号为CCTCCNO：C2019297。


2.一种杂交瘤细胞株，其特征在于：
所述杂交瘤细胞株为抗大熊猫CRP单克隆抗体杂交瘤细胞株CRP_panda_2，保藏编号为CCTCCNO：C2019298。


3.权利要求1或权利要求2所述的杂交瘤细胞株在生产抗大熊猫CRP单克隆抗体中的应用。


4.一种抗大熊猫CRP单克隆抗体，其特征在于：
所述抗大熊猫CRP单克隆抗体是由权利要求1和/或权利要求2所述的杂交瘤细胞株产生。


5.根据权利要求4所述的抗大熊猫CRP单克隆抗体，其特征在于：
所述抗大熊猫CRP单克隆抗体的亚型为IgG1。


6.权利要求4所述的抗大熊猫CRP单克隆抗体在westernblot技术中的应用。


7.权利要求4所述的抗大熊猫CRP单克隆抗体在ELISA技术中的应用。...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢军金，蔡开来，张文平，侯蓉，张梦诗，张志和，沈富军，张亮，刘佳文，王涓，刘红，
申请(专利权)人：成都大熊猫繁育研究基地，
类型：发明
国别省市：四川;51