抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗包虫病抗原单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗包虫病抗原单克隆抗体及其应用，该抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，分类命名为杂交瘤细胞株XJ10D8D10，已于2017年09月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201789。本申请对包虫病成虫表膜抗原进行提取,免疫Balb/c小鼠，获得分泌抗包虫病成虫表膜抗原的脾淋巴细胞，将其与SP2/0细胞融合获得分泌抗包虫病成虫表膜抗原的杂交瘤细胞株，从而获得抗包虫病成虫表膜抗原的抗体，该抗体作为诊断试剂，通过粪抗原检测可灵敏的检测出犬的细粒棘球绦虫的感染。为大范围普查检测试剂盒的制备提供必要条件。

Hybridoma cell lines and monoclonal antibodies against hydatid antigen and their application

【技术实现步骤摘要】
抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗包虫病抗原单克隆抗体及其应用
本申请涉及一种细粒棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株；本申请还涉及一种产生单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法。
技术介绍
包虫（棘球蚴）病是由细粒棘球绦虫引发的人兽共患寄生虫病，呈世界范围流行，且流行日趋严重，该病在东欧、环地中海所有国家、中亚、北非及南美洲高发流行。我国也是重灾区。该病的免疫诊断、化疗及终末宿主的诊断及疫苗,是当今包虫病防控工作急需解决的问题和深入研究的主要方向。包虫病在我国分布23个省区，新疆、西藏、甘肃、青海、宁夏、内蒙、四川西部等七省区为高发流行区。包虫病是西部地区农牧民因病致贫和因病返贫的主要疾病之一，同时也是影响畜牧业发展的重要疾病。包虫病高发国家经过20-100年的控制到最终消灭包虫病，证明包虫病是可以控制的，但与发达国家相比，发展中国家急需简单、有效的防控技术手段控制该病。在包虫病疫苗的研制方面，新西兰和澳大利亚合作研制成功了以绵羊为主的中间宿主用疫苗EG（细粒棘球绦虫）95，该疫苗对绵羊包虫病的保护率达95%以上，但该疫苗不能解决终末宿主感染该虫体后排卵污染环境的威胁，不能解决人被感染的问题，包虫病控制的关键在于终末宿主，因此必须开展细粒棘球绦虫终末宿主的免疫和防控研究。对包虫病流行病学调查和早期诊断进行研究十分必要，目前包虫病人的诊断主要通过影象技术确诊，现对人和终末宿主犬的免疫学诊断的研究处于初步阶段。从整个包虫病的防治上讲，存在两个方面的问题:（1）终末宿主还无免疫接种的疫苗；（2）还没有简便有效的诊断方法用于广大农牧区对人和犬的早期诊断，诊断方法有待突破，以适应于大范围普查的需要。长期的研究和实践表明要有效的防控该病就要及时发现感染犬并进行有效的治疗处理，这个问题的解决需要早期诊断方法的突破，而有效的诊断试剂的研制是创建简单有效的检测方法及产品的突破口。本专利技术所公布的EgXJ10单克隆抗体作为诊断试剂，通过粪抗原检测可灵敏的检测出犬的细粒棘球绦虫的感染。为大范围普查检测试剂盒的制备提供必要条件。
技术实现思路
本申请的目的在于提出一种抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗包虫病抗原单克隆抗体及其应用。本申请的目的是这样实现的：本申请的一种抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，分类命名为杂交瘤细胞株XJ10D8D10，已于2017年09月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，简称CCTCC)，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：C201789。抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株在制备细粒棘球绦虫检测试剂盒中的应用，为大范围普查检测试剂盒的制备提供必要条件。本申请还提供了一种抗包虫病抗原单克隆抗体，该抗包虫病抗原单克隆抗体即由上述的抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得的。抗包虫病抗原单克隆抗体在检测细粒棘球绦虫成虫中的应用。一种细粒棘球绦虫检测试剂盒，包含有所述的抗包虫病抗原单克隆抗体。一种抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：步骤一、制备细粒棘球绦虫成虫表膜抗原；步骤二、制备SP2/0细胞；步骤三、制备饲养细胞；步骤四、从小鼠身上制备待融合的脾淋巴细胞；步骤五、将1.0×108个脾淋巴细胞和2.0×107个骨髓瘤细胞进行细胞融合；步骤六、融合细胞的选择培养：脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合而成的异核体，即杂交瘤细胞由于具有两种亲代细胞的染色体，从而既可产生原来脾细胞所有的HGPRT(次黄漂呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)，又从骨髓瘤细胞中获得了在组织培养中增殖的特性，因此能在HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择性培养基中存活下来，并不断增殖；步骤七、阳性杂交瘤细胞株的筛选：待杂交瘤细胞长满孔底1/3-1/2时，换液3-4d后即可取细胞培养上清液100µL，不作稀释用间接ELISA（酶联免疫吸附试验）实验进行特异性抗体的检测，同时用SP2/0细胞培养上清液作阴性对照；检测为阳性的细胞可进行扩大培养，同时选择强阳性的孔进行亚克隆，并注意随时冻存保种；步骤八、采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞的克隆及扩增，最终制得杂交瘤细胞株XJ10D8D10；步骤九、选择生长旺盛、形态良好的处于对数生长期的细胞进行阳性杂交瘤细胞的冻存。由于实施上述技术方案，本申请对包虫病成虫表膜抗原进行提取,免疫Balb/c小鼠，获得分泌抗包虫病成虫表膜抗原的脾淋巴细胞，将其与SP2/0细胞（小鼠骨髓瘤细胞）融合获得分泌抗包虫病成虫表膜抗原的杂交瘤细胞株，从而获得抗包虫病成虫表膜抗原的抗体，该抗体作为诊断试剂，通过粪抗原检测可灵敏的检测出犬的细粒棘球绦虫的感染。为大范围普查检测试剂盒的制备提供必要条件。附图说明本申请的具体结构由以下的附图和实施例给出：图1是本申请中在不同时间内五个批次的细粒棘球绦虫成虫表膜蛋白SDS-PAGE分析图；图2是本申请中单克隆抗体与犬细粒棘球绦虫不同阶段抗原，及其他相关虫体抗原的Westernblot结果；图3是本申请中单克隆抗体的杂交瘤细胞株培养上清液与多头绦虫，泡状带绦虫、犬细粒棘球绦虫的阳性粪样特异性反应结果图；图4是本申请中杂交瘤细胞EgXJ101染色体形态（10×100倍）放大图；图5是本申请中杂交瘤细胞EgXJ102染色体形态（10×100倍）放大图；图6是本申请中经ELISA鉴定获得的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株的亚型为免疫球蛋白M(ImmunoglobulinM，IgM)的结果图；图7是本申请中通过试纸条对单克隆抗体的杂交瘤细胞株检测亚型结果图；图8是本申请中获得的单克隆抗体的杂交瘤细胞株效价示意图；图9是本申请中单克隆抗体的杂交瘤细胞株EgXJ10细胞培养上清与成虫表膜反应(10×10倍)放大图；图10是本申请中SP2/0细胞培养上清与成虫表膜反应(10×10倍)放大图。具体实施方式本申请不受下述实施例的限制，可根据本申请的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。实施例：在产生单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株前需作下列准备：一、实验试剂的准备：TritonX-100，牛血清白蛋白（BSA）、proteinassayconcertration、蛋白marker、聚乙二醇（PEG1500）、RPMI-1640、胎牛血清购自Hyclone公司、100×HT、100×HAT购自Hyclone公司、其余试剂均为国产分析纯、低分子质量标准蛋白Marker购自Promega公司；Tween-20、过硫酸铵（APS）、四甲基二乙胺（TEMED）、20×PBS浓缩液牛血清白蛋白（BSA）、邻苯二胺（OPD）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（HRP-IgG）、二甲亚砜（DMSO）、E本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于：分类命名为杂交瘤细胞株XJ10D8D10，保藏编号为CCTCC NO：C201789。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于：分类命名为杂交瘤细胞株XJ10D8D10，保藏编号为CCTCCNO：C201789。


2.如权利要求1所述的抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株在制备细粒棘球绦虫检测试剂盒中的应用。


3.一种抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、制备细粒棘球绦虫成虫表膜抗原；
步骤二、制备SP2/0细胞；
步骤三、制备饲养细胞；
步骤四、从小鼠身上制备待融合的脾淋巴细胞；
步骤五、将1.0×108个脾淋巴细胞和2.0×107个骨髓瘤细胞进行细胞融合；
步骤六、融合细胞的选择培养：脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合而成的异核体，即杂交瘤细胞由于具有两种亲代细胞的染色体，从而既可产生原来脾细胞所有的HGPRT(次黄漂呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)，又从骨髓瘤细胞中获得了在组织培养中增殖的特性，因此能在HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧...

【专利技术属性】
技术研发人员：米晓云，古努尔·吐尔逊，
申请(专利权)人：新疆畜牧科学院兽医研究所新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，
类型：发明
国别省市：新疆;65