一株三唑酮单克隆抗体杂交瘤细胞株B11S及其应用制造技术

一株三唑酮单克隆抗体杂交瘤细胞株B11S及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明专利技术三唑酮单克隆抗体杂交瘤细胞株B11S，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18518。三唑酮完全抗原免疫BALB/c小鼠。取高效价、低IC

A hybridoma cell line b11s with Triadimefon monoclonal antibody and its application

【技术实现步骤摘要】
一株三唑酮单克隆抗体杂交瘤细胞株B11S及其应用
本专利技术涉及一株三唑酮单克隆抗体杂交瘤细胞株B11S及其应用，属于食品安全免疫检测

技术介绍
三唑酮(Triadimefon，TDF)，是一种高效、广谱的唑类杀菌剂，具有预防、治疗和铲除作用，强内吸作用（能上、下传导）。对白粉病、锈病、黑穗病有特效，其杀菌作用为抑制麦角甾醇的生物合成。主要用于防治麦类、果树、蔬菜、瓜类、花卉等作物的病害。《GB2763—2016食品中农药最大残留限量》中规定了三唑酮在各类食品中的最大残留限量标准（MRL），其在麦类（小麦除外）、旱粮类（玉米除外）中的最大残留限量标准（MRL）均为0.2mg/kg，在茄果类蔬菜中的最大残留限量标准（MRL）为1mg/kg，以及在柑橘、苹果、香蕉中的最大残留限量标准（MRL）均为1mg/kg。为了有效监督监测食品中三唑酮的使用情况，需要一种特异性好，灵敏度高的测定方法，而目前检测方法如高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法等，样品前处理过程较复杂、成本昂贵，加上食品中干扰物较多，因此仪器方法并不适用于现场检测。因此建立快速便携的三唑酮检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种低成本、快速且便携的免疫学检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测出结果。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是其重要前提。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株三唑酮单克隆抗体杂交瘤细胞株B11S及其应用，由该细胞株制备的抗体对三唑酮具有较高的检测灵敏度，可以用来建立三唑酮的免疫学检测方法。本专利技术的技术方案，一株三唑酮单克隆抗体杂交瘤细胞株B11S，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCCNo.18518。三唑酮单克隆抗体，由所述保藏编号为CGMCCNo.18518的三唑酮单克隆抗体杂交瘤细胞株B11S分泌产生。本专利技术提供的三唑酮单克隆抗体杂交瘤细胞株B11S的制备基本步骤为：（1）半抗原的合成：三唑酮半抗原的合成方案如上式所示。衍生步骤简述如下：将氯乙酸钠和无水碳酸钠在2mL纯水中溶解得到溶液A，将三唑酮的结构类似物三唑醇在质量浓度95%乙醇中溶解得到溶液B。然后将A液缓慢加入B液中，在室温下搅拌10h，得到C液。将反应物过滤，滤液在80℃水浴中蒸发至干燥。然后将沉淀物TDF贮存在4℃下使用。（2）完全抗原的制备：免疫原TDF-BSA的制备：称取6.3mgTDF，1-乙基碳二亚胺盐酸盐10.3mg，N-羟基琥珀酰亚胺6.2mg，用400μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解(称为A液)，室温搅拌反应6h。取牛血清白蛋白BSA10mg，加入3mL硼酸缓冲溶液（称为B液），在室温条件，将A液缓慢加入到B液中，室温搅拌反应过夜，即得偶联物TDF-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子；包被原TDF-OVA的制备：称取2.4mgTDF，1-乙基碳二亚胺盐酸盐3.9mg，N-羟基琥珀酰亚胺2.4mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解(称为C液)，室温搅拌反应6h。称取10mg鸡卵白蛋白OVA，溶解于2mL硼酸缓冲溶液中（称为D液），在室温条件下，将C液逐滴加入到D液中，室温搅拌反应过夜，即得偶联物TDF-OVA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子。（3）小鼠的免疫：TDF-BSA完全抗原与等体积弗氏佐剂混合乳化后，通过颈背部皮下注射BALB/c小鼠。首次免疫用弗氏完全佐剂，多次加强免疫用弗氏不完全佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。最后一次用TDF-BSA完全抗原（不含佐剂）冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制率。（4）细胞融合与细胞株建立：通过PEG法将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基选择性培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测细胞孔的阳性和抑制率，通过有限稀释法对阳性及抑制率较高的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得三唑酮单克隆抗体杂交瘤细胞株B11S。（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度。取高效价低IC50小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的细胞株B11S分泌的单克隆抗体，对三唑酮具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为5.25ng/mL），可实现对果蔬、谷物中三唑酮残留量的检测，为食品中三唑酮残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。生物材料样品保藏：一株三唑酮单克隆抗体杂交瘤细胞株B11S，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCCNo.18518。附图说明图1B11S单克隆抗体对三唑酮的抑制标准曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将三唑酮完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对三唑酮有较高灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。实施例1一株三唑酮单克隆抗体杂交瘤细胞株B11S的制备（1）半抗原的合成：三唑酮半抗原的合成方案如上所示。衍生步骤简述如下：将氯乙酸钠和无水碳酸钠在2mL纯水中溶解得到溶液A，将三唑酮的结构类似物三唑醇在95%乙醇中溶解得到溶液B。然后将A液缓慢加入B液中，在室温下搅拌10h，得到C液。将反应物过滤，滤液在80℃水浴中蒸发至干燥。然后将沉淀物TDF贮存在4℃下使用。（2）完全抗原的制备：免疫原TDF-BSA的制备：称取6.3mgTDF，1-乙基碳二亚胺盐酸盐10.3mg，N-羟基琥珀酰亚胺6.2mg，用400μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解(称为A液)，室温搅拌反应6h。取牛血清白蛋白BSA10mg，加入3mL硼酸缓冲溶液（称为B液），在室温条件，将A液缓慢加入到B液中，室温搅拌反应过夜，即得偶联物TDF-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子；包被原TDF-OVA的制备：称取2.4mgTDF，1-乙基碳二亚胺盐酸盐3.9mg，N-羟基琥珀酰亚胺2.4mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解(称为C液)，室温搅拌反应6h。称取10mg鸡卵白蛋白OVA，溶解于2mL硼酸缓冲溶液中（称为D液），在室温条件下，将C液逐滴加入到D液中，室温搅拌反应过夜，即得偶联物TDF-OVA混合液，通本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株三唑酮单克隆抗体杂交瘤细胞株B11S，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18518。/n

【技术特征摘要】
1.一株三唑酮单克隆抗体杂交瘤细胞株B11S，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCCNo.18518。


2.三唑酮单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.18518的三唑酮单克隆抗体杂交瘤细胞株B11S分泌产生。


3.三唑酮半抗原的合成，其特征在于步骤为：将氯乙酸钠和无水碳酸钠在2mL纯水中溶解得到溶液A，将三唑酮的结构类似物三唑醇在质量浓度为95%的乙醇中溶解得到溶液B；然后将A液缓慢加入B液中，在室温下搅拌10h，得到C液；将反应物过滤，滤液在80℃水浴中蒸发至干燥，然后将沉淀物TDF贮存在4℃下使用。


4.三唑酮完全抗原的合成，其特征在于步骤为：
（1）免疫原TDF-BSA的制备：称...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡华，林璐，胥传来，徐丽广，孙茂忠，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，郝昌龙，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32