一种用于检测犬瘟热病毒和犬细小病毒的杂交瘤细胞株及其双重检测试纸卡制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测犬瘟热病毒和犬细小病毒的杂交瘤细胞株及其双重检测试纸卡。本发明专利技术通过实验获得4株杂交瘤细胞株T1‑T4(选择了2株1F2和6D6进行保藏)及其分泌的单克隆抗体，获得的单克隆抗体用于制备犬瘟热病毒和犬细小病毒的双重检测试纸卡。制备获得的犬瘟热病毒和犬细小病毒的双重检测试纸卡具有高灵敏度、高特异性、高准确度，可一步同时检测样品中犬细小病毒和犬瘟热病毒，具有操作简便快速、肉眼可判读结果、结果易保存、无需特殊仪器(设备)和试剂等优点。

A hybridoma cell line for detection of canine distemper virus and canine parvovirus and its double detection test card

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测犬瘟热病毒和犬细小病毒的杂交瘤细胞株及其双重检测试纸卡
本专利技术属于生物
，具体涉及一种犬瘟热病毒和犬细小病毒的杂交瘤细胞株及其双重检测试纸卡。
技术介绍
犬瘟热病毒病和犬细小病毒病是当前严重危害犬只健康的最主要疫病，两种病在发病早期引起的临床症状相似且常为混合感染，单凭临床症状往往难以做出鉴别出具体是哪种病毒感染，必须借助实验室检测手段。现行国家标准中规定的常用检测方法有三种，分别为免疫酶方法、免疫组织化学方法以及RT-PCR方法。临床上也只有一次测试仅能检测一种病毒的胶体金技术。应用国标中方法对犬瘟热病毒和犬细小病毒进行检测，不仅仪器程度化要求高，并且需要经过繁琐过程，检测时间长，费用较高，不利于在动物医院等地推广使用，而且，这些方法都需要专业技术人员进行操作。应用胶体金诊断技术对病原体检测的技术颇多，基本原理大同小异，都是双抗夹心法检测病原，包括畜禽疫病的各种病毒。目前市面上也存在有单独检测犬瘟热病毒和犬细小病毒的胶体金试纸条，但其检测灵敏度低，需要浓度高的病毒才能检测出，导致检测过程中出现漏检、假阴性结果；且仅有单一的胶体金检测方法，无法同时检测两种病毒，使用成本还是较高。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术的目的一是提供用于检测犬瘟热和犬细小病毒的杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体。本专利技术的另一目的是提供一种犬瘟热病毒和犬细小病毒双重检测试纸卡，该检测试纸卡可同时用于检测犬瘟热病毒和犬细小病毒。为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：一种以犬瘟热病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗犬瘟热病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1，名称为T1(5C3)，命名为1F2。一种以犬瘟热病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗犬瘟热病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2，名称为T2(3G7)。经过比较，根据性能选择了1F2细胞株进行保藏，该细胞株已于2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.18537。由杂交瘤细胞株1F2分泌的特异性单克隆抗体命名为T1anti，来源于小鼠属小鼠(Musmusculus)，另外含有T1anti的表达载体、转基因细胞系或宿主菌也属于本专利技术。由杂交瘤细胞株T2分泌的特异性单克隆抗体命名为T2anti，来源于小鼠属小鼠(Musmusculus)，另外含有T2anti的表达载体、转基因细胞系或宿主菌也属于本专利技术。一种以犬细小病毒F2b型为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗犬细小病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3，名称为T3(4E6)，命名为6D6。一种以犬细小病毒F2c型为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗犬细小病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4，名称为T4(5D4)。经过比较，根据性能选择了杂交瘤细胞株6D6进行保藏，该细胞株已于2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.18538。由杂交瘤细胞株6D6分泌的特异性单克隆抗体命名为T3anti，来源于小鼠属小鼠(Musmusculus)，另外含有T3anti的表达载体、转基因细胞系或宿主菌也属于本专利技术。由杂交瘤细胞株T4分泌的特异性单克隆抗体命名为T4anti，来源于小鼠属小鼠(Musmusculus)，另外含有T4anti的表达载体、转基因细胞系或宿主菌也属于本专利技术。一种制备杂交瘤细胞株T1-T4及其分泌的单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：S1、用犬瘟热病毒或犬细小病毒作为免疫原免疫动物；S2、分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤；S3、筛选杂交瘤细胞，得到杂交瘤细胞株T1-T4；S4、从杂交瘤细胞株T1-T4的培养液或接种杂交瘤细胞株T1-T4的动物的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体。一种制备杂交瘤细胞株1F2和T2及其分泌的单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：S1、用犬瘟热病毒作为免疫原免疫动物；S2、分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤；S3、筛选杂交瘤细胞，得到杂交瘤细胞株1F2和T2；S4、从杂交瘤细胞株1F2和T2的培养液或接种杂交瘤细胞株1F2和T2的动物的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体。一种制备杂交瘤细胞株6D6和T4及其分泌的单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：S1、用犬细小病毒作为免疫原免疫动物；S2、分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤；S3、筛选杂交瘤细胞，得到杂交瘤细胞株6D6和T4；S4、从杂交瘤细胞株6D6和T4的培养液或接种杂交瘤细胞株6D6和T4的动物的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体。如上所述的方法中，在步骤S1中，所述犬瘟热或犬细小病毒可为活病毒或灭活病毒，优选为灭活病毒，浓度为5-1000μg/mL；所述免疫动物可为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、驴、马等哺乳动物，优选为小鼠。如上所述的方法中，在步骤S2中，当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，可分离动物的脾细胞并制备成单细胞悬液。必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞，并在适当的融合剂(如聚乙二醇)的诱导下与骨髓瘤细胞(优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合以形成杂交瘤。如上所述的方法中，在步骤S3中，在选择性培养基(如HAT培养基)中培养以筛选融合的杂交瘤细胞，并进一步可使用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的阳性抗性细胞株。如上所述的方法中，在步骤S4中，可于体外(如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(小鼠腹水)培养分泌犬瘟热和犬细小病毒单克隆抗体T1anti-T4anti的杂交瘤细胞株T1-T4，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出单克隆抗体T1anti-T4anti。如上所述的方法中，在步骤S4中，可于体外(如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(小鼠腹水)培养分泌犬瘟热病毒单克隆抗体T1anti或T2anti的杂交瘤细胞株1F2或T2，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出单克隆抗体。如上所述的方法中，在步骤S4中，可于体外(如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(小鼠腹水)培养分泌犬细小病毒单克隆抗体T3anti或T4anti的杂交瘤细胞株6D6或T4，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出单克隆抗体。一种犬瘟热病毒和犬细小病毒双重检测试纸卡，其包括玻璃纤维膜样品垫、结合物释放垫、吸水垫、硝酸纤维素膜(NC膜)，硝酸纤维素膜上设有检测线T1线和T2线及质控线即C线，所述T1线和T2线为分别包被有犬瘟热病毒单克隆抗体和犬细小病毒的单克隆抗体，所述质控线包被有羊抗鼠免疫球蛋白。进一步的，所述结合物释放垫为玻璃纤维膜上包被有标记有犬瘟热病毒和犬细小病毒的单克隆抗体的胶体金。进一步的，所述犬瘟热病毒的单克隆抗体为权利要求1和2杂交瘤细胞株分泌获得，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以犬瘟热病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗犬瘟热病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1，名称为T1，命名为1F2。/n

【技术特征摘要】
20190228 CN 20191015325351.一种以犬瘟热病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗犬瘟热病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1，名称为T1，命名为1F2。


2.一种以犬瘟热病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗犬瘟热病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2，名称为T2。


3.一种以犬细小病毒F2b型为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗犬细小病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3，名称为T3，命名为6D6。


4.一种以犬细小病毒F2c型为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗犬细小病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4，名称为T4。


5.一种犬瘟热病毒和犬细小病毒双重检测试纸卡，其包括玻璃纤维膜样品垫、结合物释放垫、吸水垫、硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设有检测线T1线和T2线及质控线，所述T1线和T2线为分别包被有犬瘟热病毒的单克隆抗体和犬细小病毒的单克隆抗体，所述质控线包被有羊抗鼠免疫球...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓柏林，郑雪莹，郑金来，宋彦军，陈会玲，郭俊林，刘庆斌，韦海涛，李志军，
申请(专利权)人：北京市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：北京;11