高尔基体蛋白73的单克隆抗体、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术涉及高尔基体蛋白73单克隆抗体、包含该抗体的试剂盒及其在检测高尔基体蛋白73中的应用。本发明专利技术同时涉及检测血清中高尔基体蛋白73水平的方法。将包含所述GP73单克隆抗体检测试剂盒用于检测人血清中的GP73，灵敏度高，特异性强。并且，本发明专利技术提供的试剂盒和方法在临床上可用于肝硬化的辅助诊断。

【技术实现步骤摘要】
高尔基体蛋白73的单克隆抗体、试剂盒及应用
本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及高尔基体蛋白73的单克隆抗体、包含该抗体的试剂盒以及在检测高尔基体蛋白73中的应用。
技术介绍
肝硬化是各种慢性肝病发展的晚期阶段，由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。在我国大多数为肝炎后肝硬化，少部分为酒精性肝硬化和血吸虫性肝硬化。病理组织学上有广泛的肝细胞坏死、残存肝细胞结节性再生、结缔组织增生与纤维隔形成，导致肝小叶结构破坏和假小叶形成，肝脏逐渐变形、变硬而发展为肝硬化。早期由于肝脏代偿功能较强可无明显症状，后期则以肝功能损害和门脉高压为主要表现，并有多系统受累，晚期常出现上消化道出血、肝性脑病、继发感染、脾功能亢进、腹水以及癌变等并发症。目前诊断肝硬化的方法主要包括：影像学检查，肝活检和实验室血清学检测等。影像学检查结果可靠，但只有肝脏组织结构发生明显变化时才能发现，因而不利于早期诊断。肝脏活检可以建立明确诊断，但是由于其创伤性很难为患者接受。而目前实验室血清学检测方法很难给出肝硬化的明确诊断，以肝纤维化阶段的四项检查(Ⅲ型前胶原，Ⅳ型胶原，层粘连蛋白和透明质酸)为例，因为受到肝脏炎症的影响较大，其特异性和灵敏度均不高，不能满足临床诊断肝硬化的要求。高尔基体蛋白73(Golgiprotein73,GP73)是2000年Kladney等在研究成人巨细胞性肝炎病原学时首次被发现的。GP73是一种高尔基体跨膜糖蛋白，在电泳中显示的相对分子量是73KD，因此被命名为GP73。编码GP73蛋白的基因位于第9号染色体，全长共3080个核苷酸，编码区位于199～1404nt基因，内含惟一开放读码框(1200～1430bp)。GP73定位于高尔基体的顺面，在体内发生糖基化并富含酸性氨基酸，主要分为5个部分：N端的1到12位氨基酸是胞质结构域，位于细胞质内；12到35位氨基酸是跨膜结构域；36到205位氨基酸是卷曲螺旋结构，负责与其他蛋白相互作用；206位到348位氨基酸是无定形结构域；349位到402位氨基酸是酸性片段区，具有亲水性。N端为疏水末端，主要位于高尔基体内，构成跨膜区和信号肽切割位点。C端位于高尔基体外，包含有十四(烷)酰化连续序列、五个糖基化位点、一个酸性结构域和一个卷曲螺旋结构。研究发现，GP73主要在胆管上皮细胞中表达，肝细胞中没有或很少表达。在良性肝病进展过程中有表达量逐渐增多的趋势，从急慢性肝炎到肝硬化GP73的表达量逐渐增多，以肝硬化组织表达最高。GP73的表达途径可能存在不同的机制：一种由急性肝细胞损伤触发，而另一种存在于慢性肝脏疾病进展过程中。有学者认为GP73蛋白是通过其细胞外的卷曲螺旋区与其他蛋白质发生作用，是维持肝、肾等内脏器官生长发育的重要物质，并且在哺乳动物及两栖动物胚胎时期的前肾发育成熟过程中起着至关重要的作用。
技术实现思路
本专利技术通过对高尔基体蛋白73(可简称为GP73)蛋白全长序列的分析，选择了GP73aa180-aa280进行表达。用表达的GP73aa180-aa280抗原制备杂交瘤细胞，进而获得针对GP73aa180-aa280片段抗原表位的单克隆抗体。将所述GP73单克隆抗体制备检测试剂盒并用于检测人血清中的GP73，灵敏度高，特异性强。具体而言：本专利技术的第一目的在于提供高尔基体蛋白73单抗杂交瘤细胞株。本专利技术提供的第一株高尔基体蛋白73单抗杂交瘤细胞株，即GP73单抗细胞株-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.19282，保藏日期2020年1月2日，分类命名为：杂交瘤细胞株。本专利技术提供的第二株高尔基体蛋白73单抗杂交瘤细胞株，即GP73单抗细胞株-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.19283，保藏日期2020年1月2日，分类命名为：杂交瘤细胞株。本专利技术的第二目的是提供高尔基体蛋白73的单克隆抗体。该抗体由所述的杂交瘤细胞株分泌。本专利技术的第三目的是提供包含所述高尔基体蛋白73的单克隆抗体的试剂盒。本专利技术所述试剂盒可以是胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。作为本专利技术的一种优选方案，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。作为本专利技术的一种优选方案，所述酶联免疫试剂盒中包含：用所述高尔基体蛋白73单克隆抗体包被的酶标板，以及所述高尔基体蛋白73单克隆抗体与辣根过氧化物酶的结合物。本专利技术使用单克隆抗体包被酶标板以及标记辣根过氧化物酶，相比多克隆抗体，单克隆抗体具有高特异性、高均一性、高重复性等特点，制备的试剂盒稳定性好。作为本专利技术的一种优选方案，所述酶联免疫试剂盒中包含的校准品为液体蛋白标准品，由GP73蛋白溶于稀释液制备而成。所述液体蛋白标准品中优选加入0.03～0.07％的硫柳汞和0.03～0.07％的Proclin300防腐剂，可以使GP73蛋白在2～8℃长时间稳定贮存于液体中，保质期可达9个月。其他同类试剂盒中的校准品大多为冻干品，或者需要-20℃保存，使用前需要稀释，操作复杂，易产生误差。作为本专利技术的一种优选方案，所述酶联免疫试剂盒中包含的显色剂为单组分TMB显色液。所述TMB，即3,3',5,5'-四甲基联苯胺，为白色结晶粉末，无嗅、无味，难溶于水，易溶于丙酮、乙醚、二甲亚砜、二甲基甲酰胺等有机溶剂，是一种新型安全的色原试剂。本专利技术采用单组分显色液体，可以避免双组份显色液分开配制以及使用前再混合导致的操作复杂、批间差大等缺陷，减少了操作步骤，提高了准确性。所述试剂盒中还可以进一步包括洗涤液、终止液、封板膜等组分。本专利技术的第四目的是提供所述杂交瘤细胞株、所述单克隆抗体或所述试剂盒在检测血清中高尔基体蛋白73中的应用。本专利技术的第五目的是提供采用所述杂交瘤细胞株、所述单克隆抗体或所述试剂盒检测血清中高尔基体蛋白73的方法。为了提高检测的准确性，本专利技术优选采用包括如下步骤的方法获得待测样品：采集静脉血，放置半小时以上充分凝固后，以转速1300～1500rpm水平离心5～10min，取上层血清。作为本专利技术的一种优选方案，所述方法采用双抗体夹心法对目标物质(即高尔基体蛋白73)进行定量检测。在实际操作中，在高尔基体蛋白73单克隆抗体包被的酶标板中，加入待测样品进行反应，加入高尔基体蛋白73单克隆抗体与辣根过氧化物酶的结合物，再与显色剂作用，显色强度与待测样品中目标物质的浓度相关。本专利技术提供的方法测定人血清中GP73含量，反应时间短，与同类ELIS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高尔基体蛋白73单抗杂交瘤细胞株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19282或CGMCC No.19283。/n

【技术特征摘要】
1.高尔基体蛋白73单抗杂交瘤细胞株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.19282或CGMCCNo.19283。


2.高尔基体蛋白73的单克隆抗体，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌。


3.包含权利要求2所述高尔基体蛋白73的单克隆抗体的试剂盒。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒，其中包含：用所述高尔基体蛋白73单克隆抗体包被的酶标板，以及所述高尔基体蛋白73单克隆抗体与辣根过氧化物酶的结合物。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒中还包含液体蛋白校准品，由高尔基体蛋白73蛋白溶于稀释液制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：王卫东，
申请(专利权)人：海南众森生物科技有限公司，天津金虹生物科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：海南;46