一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用制造技术

一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明专利技术赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC09，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19162。首先合成赛拉嗪半抗原，再制备赛拉嗪完全抗原，并将它免疫BALB/c小鼠，取高效价、低IC

【技术实现步骤摘要】
一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测

技术介绍
赛拉嗪（Xylazine，XYL）为镇痛性化学保定药，主要用于马、牛、羊等动物的镇静与镇痛。研究表明，赛拉嗪在食源性动物组织中的残留对消费者造成的健康风险很大，长期使用含有赛拉嗪残留动物源食品可能会出现恶心、呕吐、头晕，个别患者会出现精神失常。因此，建立有效的赛拉嗪残留检测方法，对有效控制牛奶产品中赛拉嗪的残留，保障广大人民群众的身体健康，具有深远的意义。赛拉嗪的传统检测方法有高效液相色谱，液相色谱/串联质谱和气相色谱/串联质谱等，然而这些方法的前处理比较复杂、费时，不适用于大量样品的快速检测，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对赛拉嗪的高效、快速的检测方法。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，然而，使用酶联免疫法检测赛拉嗪的前提是得到对赛拉嗪具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对赛拉嗪具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的抗体对赛拉嗪具有较高的检测灵敏度，可以用来建立赛拉嗪的免疫学检测方法。本专利技术的技术方案，一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC09，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCCNo.19162。赛拉嗪单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCCNo.19162的赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC09分泌产生。免疫原赛拉嗪-BSA的合成，具体步骤如下：（1）赛拉嗪半抗原的制备：将赛拉嗪（570mg，2.59mmol）和1,5-戊二酰氯（480.99mg，2.85mmol）溶于二氯甲烷（5mL），并在冰浴中冷却。然后将溶解在二氯甲烷（5mL）中的三乙胺（TEA）（314.18mg，3.10mmol）添加至所述溶有赛拉嗪的混合液中。添加30min后，温度逐渐升至室温。通过薄层色谱法（TLC）证明原料已被消耗。将反应混合物在真空中浓缩，并通过快速柱色谱法纯化（DCM：MeOH，1：0逐渐增加至40：1），得到化合物1（660mg，1.70mmol，产率65.60％（w/w））。将化合物1（660mg，1.70mmol）溶于N，N-二甲基甲酰（3mL）。然后将溶液加入水（3mL）中，在其中白色固体会分离出来。过滤收集产物，随后用DCM洗涤3次，并在真空下干燥。产生的白色固体即为赛拉嗪半抗原（412mg，1.23mmol，产率72.65％（w/w））。半抗原合成路线详见实施例1杂交瘤细胞株ABC09的制备。（2）免疫原赛拉嗪-BSA的制备：称取1.48mg的赛拉嗪半抗原将其溶解在600μLDMF中，然后加入2.52mgEDC，1.52mgNHS，该混合物在室温搅拌6h，得到反应液A；称取5mgBSA，溶解于0.1M硼酸盐缓冲液中，得到溶液B；随后，逐滴将A液加入到B液中，室温反应8h，即得偶联物赛拉嗪-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原赛拉嗪-BSA。本专利技术的赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选方法，主要包括以下步骤：（1）小鼠的免疫：将免疫原赛拉嗪-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用赛拉嗪-BSA完全抗原（不含佐剂）冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制；（2）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC09。杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。所述赛拉嗪单克隆抗体的应用，建立赛拉嗪含量的免疫检测方法，应用于食品中赛拉嗪的检测。进一步地，所述检测领域为乳品和其他含有赛拉嗪的食品检测。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对赛拉嗪具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为0.39ng/mL），为检测乳品和其他含有赛拉嗪的食品中赛拉嗪含量提供了免疫学方法。本专利技术提供的赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测赛拉嗪的试剂盒，具有实际应用价值。生物材料样品保藏：一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC09，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCCNo.19162。附图说明图1ABC09赛拉嗪单克隆抗体对赛拉嗪的抑制标准曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将赛拉嗪完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对赛拉嗪有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。实施例1杂交瘤细胞株ABC09的制备（1）完全抗原的制备：a、半抗原合成路线如下：将赛拉嗪（570mg，2.59mmol）和1,5-戊二酰氯（480.99mg，2.85mmol）溶于二氯甲烷（5mL），并在冰浴中冷却。然后将溶解在二氯甲烷（5mL）中的三乙胺（314.18mg，3.10mmol）添加至混合物。添加30分钟后，温度逐渐升至室温。通过薄层色谱法证明原料已被消耗。将反应混合物在真空中浓缩，并通过快速柱色谱法纯化（二氯甲烷：MeOH，1：0逐渐增加至40：1），得到化合物1（660mg，1.70mmol，产率65.60％（w/w））。将化合物1（660mg，1.70mmol）溶于N,N-二甲基甲酰（3mL）。然后将溶液加入水（3mL）中，在其中白色固体会分离出来。过滤收集产物，随后用二氯甲烷洗涤3次，并在真空下干燥。产生的白色固体即为赛拉嗪半抗原（412mg，1.23mmol，产率72.65％（w/w））。b、称取1.48mg的赛拉嗪半抗原将其溶解在600μLDMF中，然后加入2.52mgEDC，1.52mgNHS，该混合物在室温搅拌6h，得到反应液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC09，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19162。/n

【技术特征摘要】
1.一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC09，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCCNo.19162。


2.赛拉嗪单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.19162的赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC09分泌产生。


3.赛拉嗪半抗原的合成，其特征在于步骤为：将赛拉嗪2.59mmol和1,5-戊二酰氯2.85mmol溶于5mL二氯甲烷，并在冰浴中冷却；然后另将溶解在5mL二氯甲烷中的三乙胺3.10mmol添加至所述溶有赛拉嗪的混合液中；添加30min后，温度逐渐升至室温；通过薄层色谱法TLC证明原料已被消耗；将反应混合物在真空中浓缩，并通过快速柱色谱法纯化，DCM：MeOH体积比自1：0逐渐增加至40：1，得到化合物1；将66...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，晁梦佳，匡华，徐丽广，孙茂忠，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，郝昌龙，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32