基因组工程制造技术

提供了使用缺少重复序列的TALEN或Cas9的细胞中基因组工程的方法。

Genome engineering

【技术实现步骤摘要】
基因组工程相关申请数据本申请要求于2013年7月26日提交的美国临时专利申请号61/858,866的优先权，并且针对所有目的将该申请的全部内容通过引用结合于此。政府权益声明本专利技术在来自国家人类基因组研究中心的基因组科学卓越奖P50HG003170下获得政府支持。政府对本专利技术享有一定权利。
技术介绍
已知通过序列特异性核酸酶的基因组编辑。参见参考文献1、2和3，通过引用将其全部内容结合于此。可以通过两种主要机制修复基因组中断裂的核酸酶介导的双链DNA(dsDNA)：非同源性末端接合(Non-HomologousEndJoining，NHEJ)，其通常导致引入非特异性的插入和缺失(插入缺失(indels))，或同源介导修复(HDR)，其引入作为修复模板的同源链。参见参考文献4，通过引用将其全部内容结合于此。当序列特异性核酸酶与包含所希望突变的同源供体DNA构建体一同递送时，与仅单独的供体构建体相比，基因靶向效率增加了1000倍。参见参考文献5，通过引用将其全部内容结合于此。已经报告了将单链寡脱氧核糖核酸(“ssODN”)用作DNA供体。参见参考文献21和22，通过引用将其全部内容结合于此。尽管基因编辑工具上有较大进步，但是对于在人类诱导多能干细胞(“hiPSC”)工程中使用定制设计的核酸酶存在许多挑战和问题。首先，尽管它们设计简化，但是转录激活因子样效应物核酸酶(TranscriptionActivator-LikeEffectorsNucleases，TALEN)通过重复可变二残基(RVD)结构域的串联拷贝靶向特定的DNA序列。参见参考文献6，通过引用将其全部内容结合于此。尽管RVD的模块化性质简化TALEN设计，但是它们的重复序列使用于合成它们的DNA构建体的方法复杂化(参见参考文献2、9和15-19，通过引用将其全部内容结合于此)，而且削弱了它们伴随慢病毒基因递送载体的使用。参见参考文献13，通过引用将其全部内容结合于此。在目前的实践中，通常使用独立的测定法评估NHEJ和HDR。往往使用错配敏感性核酸内切酶测定法(参见参考文献14，通过引用将其全部内容结合于此)测定NHEJ，但是该方法的定量准确度可变并且敏感度局限于NHEJ频率大于～3％。参见参考文献15，通过引用将其全部内容结合于此。通常通过克隆和测序评价HDR，克隆和测序是完全不同并往往是繁琐的程序。灵敏度仍是问题，因为通常针对诸如U2OS和K562(参见参考文献12和14，通过引用将其全部内容结合于此)的某些细胞类型报告50％数量级的高编辑频率，但是hiPSC中的频率一般较低。参见参考文献10，通过引用将其全部内容结合于此。近年来，报告了在hiPSC和hESC中使用TALEN的高编辑频率(参见参考文献9，通过引用将其全部内容结合于此)，以及用CRISPRCas9-gRNA系统的甚至更高的频率(参见参考文献16-19，通过引用将其全部内容结合于此)。然而，不同位点处的编辑速率看起来变化广泛(参见参考文献17，通过引用将其全部内容结合于此)，并且在一些位点处的编辑有时根本不可检测(参见参考文献20，通过引用将其全部内容结合于此)。细菌和古细菌(archaeal)CRISPR-Cas系统凭借与Cas蛋白的复合物中的短向导RNA引导存在于侵略外源核酸内的互补序列的降解。参见Deltcheva,E.etal.CRISPRRNAmaturationbytrans-encodedsmallRNAandhostfactorRNaseIII.Nature471,602-607(2011)；Gasiunas,G.,Barrangou,R.,Horvath,P.&Siksnys,V.Cas9-crRNAribonucleoproteincomplexmediatesspecificDNAcleavageforadaptiveimmunityinbacteria.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica109,E2579-2586(2012)；Jinek,M.etal.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science337,816-821(2012)；Sapranauskas,R.etal.TheStreptococcusthermophilusCRISPR/CassystemprovidesimmunityinEscherichiacoli.Nucleicacidsresearch39,9275-9282(2011)；和Bhaya,D.,Davison,M.&Barrangou,R.CRISPR-Cassystemsinbacteriaandarchaea:versatilesmallRNAsforadaptivedefenseandregulation.Annualreviewofgenetics45,273-297(2011)。最近化脓性链球菌(S.pyogenes)II型CRISPR系统的体外重构证实了融合至标准的反式编码tracrRNA(“反式激活的CRISPRRNA”)的crRNA(“CRISPRRNA”)足以引导Cas9蛋白序列特异性裂解匹配crRNA的靶DNA序列。表达与靶位点同源的gRNA导致Cas9的招募(recruitment)和靶DNA的降解。参见H.Deveauetal.,PhageresponsetoCRISPR-encodedresistanceinStreptococcusthermophilus.JournalofBacteriology190,1390(Feb,2008)。
技术实现思路
本公开的方面涉及使用修饰的转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)用于基因修饰(改造，modify)细胞，诸如体细胞或干细胞。已知TALEN包含重复序列。本公开的方面涉及在细胞中改变靶DNA的方法，包括将缺少100bp或更长重复序列的TALEN引入至细胞，其中，TALEN裂解靶DNA并且细胞经历非同源性末端接合以在细胞中产生改变的DNA。根据某些方面，已经从TALEN中除去了具有希望长度的重复序列。根据某些方面，TALEN缺乏具有某些希望长度的重复序列。根据某些方面，对TALEN提供了希望长度的重复序列的除去。根据某些方面，修饰TALEN以除去具有希望长度的重复序列。根据某些方面，工程化TALEN以除去具有希望长度的重复序列。本公开的方面包括改变细胞中的靶DNA的方法，包括在细胞内结合缺少100bp或更长重复序列的TALEN和供体核酸序列，其中，TALEN裂解靶DNA并且将供体核酸序列插入至细胞中的DNA。本公开的方面涉及包含编码缺少100bp或更长重复序列的TALEN的核酸序列的病毒。本公开的方面涉及包含编码缺少100bp或更长重复序列的TALEN的核酸序列的细胞。根据本文描述的某些方面，TALEN缺少100bp或更长、90本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在表达Cas酶的细胞中改变靶DNA的方法，所述酶与互补于所述靶DNA的向导RNA形成共定位复合物并以位点特异性方式裂解所述靶DNA，所述方法包括：/n(a)将供体核酸序列引入至所述细胞中，/n将与所述靶DNA互补的向导RNA引入至所述细胞中，其中，所述向导RNA和所述Cas酶是用于所述靶DNA的共定位复合物的成员，/n其中，所述向导RNA和所述Cas酶共定位至所述靶DNA，所述Cas酶裂解所述靶DNA并且所述供体核酸插入至所述靶DNA以在所述细胞中产生改变的DNA。/n

【技术特征摘要】
20130726 US 61/858,8661.一种在表达Cas酶的细胞中改变靶DNA的方法，所述酶与互补于所述靶DNA的向导RNA形成共定位复合物并以位点特异性方式裂解所述靶DNA，所述方法包括：
(a)将供体核酸序列引入至所述细胞中，
将与所述靶DNA互补的向导RNA引入至所述细胞中，其中，所述向导RNA和所述Cas酶是用于所述靶DNA的共定位复合物的成员，
其中，所述向导RNA和所述Cas酶共定位至所述靶DNA，所述Cas酶裂解所述靶DNA并且所述供体核酸插入至所述靶DNA以在所述细胞中产生改变的DNA。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述RNA包括5'帽结构。


3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述RNA缺少磷酸酯基团。


4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酶是Cas9。


5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述RNA在约10至约500个核苷酸之间。


6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述RNA在约20至约100个核苷酸之间。


7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述向导RNA是tracrRNA-crRNA融合体。


8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA是基因组DNA、线粒体DNA、病毒DNA或外源DNA。


9.根据权利要求1所述的方法，其中，通过重组插入所述供体核酸序列。


10.根据权利要求1所述的方法，其中，通过同源重组插入所述供体核酸序列。


11.根据权利要求1所述的方法，其中，通过非同源性末端接合插入所述供体核酸序列。


12.根据权利要求1所述的方法，进一步包括重复步骤(a)以在所述细胞中产生所述DNA的多重改变。


13.根据权利要求1所述的方法，其中，在细胞中产生改变的DNA之后，...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔治·M·丘奇，杨璐菡，马克·格尔·卡戈尔，乔伊斯·利奇·扬，
申请(专利权)人：哈佛大学校长及研究员协会，
类型：发明
国别省市：美国;US