提供了用于体内RNA或蛋白质表达的方法。该方法包括将双链多联体DNA引入真核细胞内，以生成所需RNA或蛋白质。双链多联体DNA包括多个串联重复序列，其中所述多个串联重复序列各自包含表达序列。双链多联体DNA包含一个或多个硫代磷酸酯化的核苷酸，其中所述双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为至少1：1600。还提供了包含外源的双链多联体DNA的真核细胞，所述双链多联体DNA包含多个串联重复序列。
In vivo RNA or protein expression using double stranded polyhedral DNA including thiophosphorylated nucleotides
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用包括硫代磷酸酯化的核苷酸的双链多联体DNA的体内RNA或蛋白质表达专利
本公开内容总体上涉及RNA或蛋白质表达系统，其涉及双链多联体DNA的体内转录和/或翻译。本公开内容特别涉及使用包括硫代磷酸酯化的核苷酸的双链多联体DNA的体内RNA或蛋白质表达。专利技术背景各种基于蛋白质和RNA的应用的增加已增加了对于RNA和蛋白质的大规模生产的需求。这些应用中的大多数，尤其是治疗应用，需要蛋白质/RNA满足在纯度、效力、功效和安全性方面的严格质量标准。经常采用重组蛋白生产来满足所需的大规模蛋白生产的期望。非常需要更高的生产效率和更低的成本，以使这些蛋白质/RNA产物在商业上可行。传统上，对于在哺乳动物细胞中的蛋白质的体内生产，使用质粒DNA的细胞转染已用作主要工具。由相应的DNA序列产生期望的蛋白质或RNA涉及大量真核细胞的使用，并且一般以大体积规模例如100L执行。对于体内蛋白质生产，可以生成稳定的细胞系，并且扩增至足够的数量，以生成所需的蛋白质产率。进一步地，在其中表达的蛋白质对宿主细胞是致死性的情况下，可以使用瞬时生产系统。使用无细胞的体外RNA或蛋白质表达系统，还可以在更短的时期内表达显著更高数量的RNA或蛋白质。然而，体外转录-翻译系统经常需要较大量的DNA模板。一般地，质粒DNA在体内和体外转录-翻译系统中用作模板DNA。然而，用于较大规模的瞬时/稳定转染或无细胞表达的足够质粒的制造经常是昂贵且麻烦的。例如，传统的质粒生成方法需要劳动密集型的克隆和质粒纯化。进一步地，大规模质粒制备的传统方法存在被无关细菌组分和/或纯化试剂污染的风险，其可能影响下游RNA表达和后续蛋白质生产。合适的改造的DNA序列，尤其是仅含有启动子和目的基因，并且缺乏对于在细菌中的维持必需的任何不期望的DNA序列（例如，复制起点或抗生素抗性基因）的DNA序列（其可以用于在真核细胞中的转染，用于后续RNA和/或蛋白质生产）的快速、成本有效生产是高度期望的。等温DNA扩增技术，例如滚环扩增（RCA），可以用于从环状核酸模板开始生成如此大量的高质量DNA，伴随较少的劳力、时间和费用。例如，RCA使得能够快速产生合适的改造的DNA序列，例如仅含有启动子和目的基因的DNA序列。尽管使用真核细胞系和RCA产物DNA的少数RNA和蛋白质表达系统是目前可获得的，然而，这些系统具有所需蛋白质的表达率相当低的缺点，导致重组蛋白质的低产率和高成本。存在关于适当的体内RNA和/或蛋白质表达系统的需要，所述表达系统提供在商业上可行的RNA和/或蛋白质的生产中的显著改善。专利技术概述在一些实施方案中，提供了用于体内RNA或蛋白质表达的方法。该方法包括将双链多联体DNA引入真核细胞内，以生成所需RNA或蛋白质。双链多联体DNA包含多个串联重复序列，其中所述多个串联重复序列各自包含表达序列。双链多联体DNA包含一个或多个硫代磷酸酯化的核苷酸，其中所述双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为至少1：1600。在一些实施方案中，提供了包含外源的双链多联体DNA的真核细胞，所述双链多联体DNA包含多个串联重复序列。多个串联重复序列各自包含硫代磷酸酯化的核苷酸，其中硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为至少1：1600。附图简述当参考附图阅读下述详述时，本专利技术的这些及其它特点、方面和优点将变得更好理解。图1是琼脂糖凝胶电泳的图像，其示出了与超螺旋质粒DNA和缺乏硫代磷酸酯化的核苷酸的RCA产物DNA相比，包含硫代磷酸酯化的核苷酸的RCA产物DNA的体外稳定性。图2示出了在用包含硫代磷酸酯化的核苷酸的RCA产物DNA、缺乏硫代磷酸酯化的核苷酸的RCA产物DNA和超螺旋质粒DNA转染HEK293细胞后，绿色荧光蛋白（GFP）的体内表达。信号针对在第2天时确定的相对荧光单位进行标准化。图3示出了在转染后第2天和第9天时，在用包含硫代磷酸酯化的核苷酸的RCA产物DNA和超螺旋质粒DNA转染HEK293细胞后，红色荧光蛋白（RFP）的体内表达，并且指示了与超螺旋质粒DNA相比，包含硫代磷酸酯化的核苷酸（RCA-硫代C、RCA-硫代T或RCA-硫代全部）的RCA产物DNA的体内稳定性。图4示出了与超螺旋质粒DNA相比，在用包含硫代磷酸酯化的核苷酸（RCA硫代A或RCA硫代G）的RCA产物DNA转染HEK293细胞后，红色荧光蛋白（RFP）的体内表达。专利技术详述下述详述是示例性的，并且不预期限制本专利技术或本专利技术的用途。在说明书各处，特定术语的例示应该被视为非限制性的实例。除非上下文另有明确说明，否则单数形式“a”、“an”和“the”包括复数参考。如本文在说明书和权利要求书各处所使用的，近似语言可以应用于修饰任何定量表示，其在不导致它与之有关的基本功能的变化的情况下可以允许变化。相应地，由术语如“约”修饰的值并不限于所指定的精确值。除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表示成分数量、性质例如分子量、反应条件等等的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。相应地，除非指示相反，否则在下述说明书和所附权利要求书中所阐述的数字参数是近似值，其可以根据寻求通过本专利技术获得的所需特性而变。必要时，已提供了范围，并且这些范围包括其间的所有子范围。为了更清楚和简明地描述且指出本专利技术的主题，对于在下述描述和所附权利要求中使用的特定术语提供了下述定义。如本文使用的，术语“硫代磷酸酯化的核苷酸”指具有改变的磷酸酯主链的核苷酸，其中糖部分通过硫代磷酸酯键连接。在寡核苷酸序列的磷酸酯主链中，硫代磷酸酯键含有硫原子作为非桥连氧原子的替代物。这种修饰致使核苷酸间连键抵抗核酸酶降解。如本文使用的，术语“双链多联体DNA”指含有串联连接的相同DNA序列的多个拷贝的双链DNA分子。如本文使用的，术语“滚环扩增（RCA）产物DNA”指核酸扩增产物，其中环状核酸模板（例如，单链/双链DNA环）经由滚环扩增反应机制进行扩增。滚环扩增通常产生包含环状核酸模板序列的串联重复单元的多联体。滚环扩增产物DNA可以由显示出线性扩增动力学的线性RCA（LRCA）（例如，使用单个特异性引物的RCA）生成，或者由显示出指数扩增动力学的指数RCA（ERCA）生成。滚环扩增产物DNA也可以通过使用多重引物（多重引发的滚环扩增或MPRCA）生成，其中滚环扩增产物DNA是超分支的多联体。在双重引发的RCA中，一个引物可以如在线性RCA中一样与环状核酸模板互补，而另一个可以与RCA产物DNA的串联重复单元核酸序列互补。RCA产物DNA可以通过RCA在体外在等温条件下使用合适的核酸聚合酶例如Phi29DNA聚合酶生成。如本文使用的，术语“表达序列”指具有RNA和/或蛋白质表达能力的DNA序列。在其中寻求蛋白质表达的实施方案中，表达序列是有表达能力的单元，其包括与一个或多个开放读码框（ORF）可操作地连接的至少一个启动子。一个或多个ORF可以编码一种或多种相同或不同的蛋白质。在一些情况下，表达序列可以包本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于体内RNA或蛋白质表达的方法，所述方法包括：/n将双链多联体DNA引入真核细胞内，以生成所需RNA或蛋白质，/n其中所述双链多联体DNA包含多个串联重复序列，并且其中所述多个串联重复序列各自包含表达序列，/n其中所述双链多联体DNA包含一个或多个硫代磷酸酯化的核苷酸；和/n其中所述双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为至少1：1600。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170918 US 15/7070741.一种用于体内RNA或蛋白质表达的方法，所述方法包括：
将双链多联体DNA引入真核细胞内，以生成所需RNA或蛋白质，
其中所述双链多联体DNA包含多个串联重复序列，并且其中所述多个串联重复序列各自包含表达序列，
其中所述双链多联体DNA包含一个或多个硫代磷酸酯化的核苷酸；和
其中所述双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为至少1：1600。
2.权利要求1的方法，其中所述双链多联体DNA是滚环扩增（RCA）产物DNA。
3.权利要求1或2的方法，其中所述双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率在1：1600至125：1600的范围内。
4.权利要求1或2的方法，其中所述双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率在50：1600至125：1600的范围内。
5.权利要求1或2的方法，其中所述双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率在75：1600至125：1600的范围内。
6.权利要求1或2的方法，其中所述双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为125：1600。
7.上述权利要求中的一项或多项的方法，其中所述双链多联体DNA是未加工的或加工的RCA产物DNA。
8.上述权利要求中的一项或多项的方法，其中所述表达序列包含编码序列、非编码序列或其组合。
9.权利要求8的方法，其中所述编码序列包含启动子、开放读码框和任选地不依赖于帽的翻译元件（CITE）。
10.权利要求9的方法，其中所述不依赖于帽的翻译元件（CITE）包含内部核糖体进入位点（IRES）、翻译增强元件（TEE）或其组合。
11.权利要求9或10的方法，其中所述开放读码框包含密码子优化的序列用于增强翻译。
12.权利要求9、10或11的方法，其中所述开放读码框包含用于所需蛋白质的纯化的标签序列、衍生自IRES的用于增强核糖体识别的氨基末端肽融合序...
【专利技术属性】
技术研发人员：BM戴维斯，JR尼尔松，高伟，
申请(专利权)人：通用电气公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。