一种基于复制缺陷型重组腺病毒载体的寨卡病毒疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种基于复制缺陷型重组腺病毒载体的寨卡病毒疫苗，其将该JE信号肽的核苷酸序列，以及优化的编码寨卡病毒的膜蛋白prM和包膜糖蛋白E的核苷酸序列克隆入穿梭质粒载体pShuttle2‑CMV‑Flag后获得重组穿梭质粒，使得外源蛋白的表达明显提高，同时提高抗原的免疫原性；同时采用重组腺病毒表达载体SAd23‑L逃避预存的针对常见腺病毒载体的预存免疫反应，能够在动物体内诱导产生更高水平的体液和细胞免疫。此重组腺病毒作为寨卡病毒疫苗免疫动物之后快速诱导产生针对寨卡病毒的体液和细胞反应，尤其是高水平的中和抗体，而且诱导小鼠产生了特异性的针对寨卡病毒抗原M和E蛋白的细胞反应。因此此寨卡病毒疫苗可以应用于预防大规模的寨卡病毒的爆发和流行。

A Zika virus vaccine based on replication defective recombinant adenovirus vector

【技术实现步骤摘要】
一种基于复制缺陷型重组腺病毒载体的寨卡病毒疫苗
本专利技术涉及了生物
，特别是涉及了一种基于复制缺陷型重组腺病毒载体的寨卡病毒疫苗。
技术介绍
寨卡病毒（Zikavirus,ZIKV）自1947年在乌干达寨卡丛林的恒河猴中发现，是一种单股正链RNA病毒属于黄病毒科黄病毒属。世界卫生组织统计，美洲、非洲等已有30多个国家和地区报告出现寨卡病毒传播。寨卡病毒对普通人群威胁不大，可导致轻微发热或皮症，有些人可能还会出现结膜炎、肌肉和关节痛以及疲劳感。但孕妇感染后会干扰胎儿神经发育系统，可能导致胎儿流产、新生儿小头畸形甚至死亡。同时，寨卡病毒还是格林-巴利综合征（guillainbarresyndrome，GBS）的一个触发因素。寨卡病毒主要通过伊蚊传播，也可以通过性传播，母婴传播和输血传播。感染寨卡病毒的主要表现为发热（多为中低度发热）、皮疹（多为斑丘疹），并可伴有非化脓性结膜炎、肌肉和关节痛、全身乏力以及头痛，少数患者可出现腹痛、恶心、腹泻、粘膜溃疡、皮肤瘙痒等。约80％的人为隐性感染，仅有20％的人出现上述临床症状，一般持续2-7天后自愈，重症和死亡病例少见。有与寨卡病毒感染相关的格林-巴利综合征（吉兰-巴雷综合征，Guillain-BarreSyndrome）病例的报道，但二者之间的因果关系尚未明确。小儿感染病例还可出现神经系统、眼部和听力等改变。孕妇感染寨卡病毒可能导致新生儿小头畸形甚至胎儿死亡。寨卡病毒疫情中，巴西等国新生儿小头畸形病例数显著增加，疫情的快速蔓延以及与小头畸形之间的因果关系，引起了国际社会的广泛关注。我国南方部分地区存在可传播寨卡病毒的媒介伊蚊，近年来与之传播方式相似的登革热输入性疫情持续增多，并在南方部分省份引起了较大规模的暴发疫情。随着与相关国家或地区人员往来的日益密切，我国存在寨卡病毒输入风险。特别是我国南方地区夏秋季节伊蚊密度较高，一旦有病例输入，不排除在局部地区发生本地传播扩散的可能。目前全球范围内尚无有效的治疗手段对寨卡病毒病进行治疗，即使通过防止蚊虫来预防寨卡病毒侵染，在实施过程中也存在极大难度，尤其随着夏季的到来，蚊虫密度增加，根本无法完全防范蚊虫叮咬，因此，通过疫苗进行预防成为未来消灭寨卡病毒的有效手段。寨卡病毒是单股正链RNA病毒，基因组大小约11kb，包括三个结构蛋白：衣壳（C），膜蛋白（prM）和包膜糖蛋白（E），七个非结构蛋白NS1，NS2a，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5。通常寨卡病毒疫苗的目的是诱导产生广泛的中和抗体反应能够中和病毒同时保护宿主，由于膜蛋白prM和包膜糖蛋白E能够诱导产生广泛的免疫反应是寨卡病毒疫苗研制中主要呈现的抗原。目前已经有许多形式的寨卡病毒疫苗在研制，包括DNA质粒疫苗，腺病毒疫苗，改造的mRNA疫苗和灭活的病毒疫苗等。但是目前为止还没有获得批准的寨卡病毒疫苗，因此有效的预防性的寨卡病毒疫苗的研制是非常有必要的。复制缺陷型腺病毒载体广泛的应用于疫苗的研制，由于能够诱导产生广泛的体液和细胞免疫反应，宿主范围广，不整合基因组中，高水平表达外源蛋白等优点。但是人群中存在高水平的针对常见的人血清型的腺病毒（Ad5或者Ad2）的免疫反应限制了腺病毒载体的应用。因此为了克服这种预存的免疫反应，需要进一步开发人稀有血清型或者猴血清型的腺病毒载体。
技术实现思路
为了弥补已有技术的缺陷，本专利技术提供而提供一种预防寨卡病毒感染效果更好的基于复制缺陷型重组腺病毒载体的寨卡病毒疫苗。本专利技术所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：本专利技术的第一方面，提供了一种重组穿梭质粒，其含有JE信号肽的核苷酸序列、以及编码寨卡病毒的膜蛋白prM和包膜糖蛋白E的核苷酸序列；其中，所述JE信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述编码寨卡病毒的膜蛋白prM和包膜糖蛋白E的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。进一步地，所述重组穿梭质粒为pShuttle2-CMV-JE-prM-E。本专利技术的第二方面，提供了一种复制缺陷型重组腺病毒载体，其是将上述重组穿梭质粒克隆入重组腺病毒载体而得，其中所述重组腺病毒载体为中国专利文献CN109797168A公开的重组腺病毒表达载体SAd23-L。本专利技术的第三方面，提供了一种复制缺陷型重组腺病毒，其由上述复制缺陷型重组腺病毒载体制备而成。本专利技术的第四方面，提供了所述复制缺陷型重组腺病毒的制备方法，包括如下步骤：（1）构建上述重组穿梭质粒；（2）将所述重组穿梭质粒克隆入重组腺病毒载体，获得复制缺陷型重组腺病毒载体；（3）将所述的复制缺陷型重组腺病毒载体线性化后转染至病毒包装细胞中进行包装、扩增、纯化后获得复制缺陷型重组腺病毒。进一步地，步骤（3）所述病毒包装细胞为HEK293细胞。进一步地，步骤（3）中所述线性化的内切酶为PacI。本专利技术的第五方面，提供了一种寨卡病毒疫苗，其活性成分为上述复制缺陷型重组腺病毒。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术中，JE信号肽的核苷酸序列能够提高外源基因的表达水平，对编码寨卡病毒的膜蛋白prM和包膜糖蛋白E（prM-E）的核苷酸序列进行优化；将该JE信号肽的核苷酸序列，以及优化的编码寨卡病毒的prM-E的核苷酸序列克隆入穿梭质粒载体pShuttle2-CMV-Flag后获得重组穿梭质粒，使得外源蛋白的表达明显提高，同时提高抗原的免疫原性。同时采用中国专利文献CN109797168A公开的重组腺病毒表达载体SAd23-L逃避预存的针对常见腺病毒载体的预存免疫反应，能够在动物体内诱导产生更高水平的体液和细胞免疫。本专利技术的复制缺陷型重组腺病毒载体携带能够提高外源基因表达的JE信号肽和源于亚洲型寨卡病毒毒株Z16006(GenBankno.KU955589.1)的膜蛋白prM和包膜糖蛋白E的基因。携带外源基因的重组腺病毒载体能够感染细胞之后高水平表达寨卡病毒的包膜糖蛋白，同时此重组腺病毒作为寨卡病毒疫苗免疫动物之后快速诱导产生针对寨卡病毒的体液和细胞反应，尤其是高水平的中和抗体，而且诱导小鼠产生了特异性的针对寨卡病毒抗原M和E蛋白的细胞反应。因此此寨卡病毒疫苗可以应用于大规模的寨卡病毒的爆发和流行。附图说明图1为本专利技术构建复制缺陷型重组腺病毒载体SAd23-L-prM-E的流程图；图2为本专利技术复制缺陷型重组腺病毒载体SAd23-L-prM-E的酶切鉴定结果；图3为本专利技术包装复制缺陷型重组腺病毒载体SAd23-L-prM-E的图；图4为本专利技术复复制缺陷型重组腺病毒载体SAd23-L-prM-E表达寨卡病毒E蛋白的Westernblot鉴定图；图5为本专利技术复制缺陷型重组腺病毒载体SAd23-L-prM-E表达寨卡病毒E蛋白的免疫荧光鉴定图；图6为本专利技术氯化铯梯度离心纯化的复制缺陷型重组腺病毒；图7为本专利技术复制缺陷型重组腺病毒免疫小鼠四周之后血清中E蛋白特异性结合抗体水平；图8为本专利技术复制缺陷型重组腺病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组穿梭质粒，其特征在于，其含有JE信号肽的核苷酸序列、以及编码寨卡病毒的膜蛋白prM和包膜糖蛋白E的核苷酸序列；其中，所述JE信号肽的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；所述编码寨卡病毒的膜蛋白prM和包膜糖蛋白E的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组穿梭质粒，其特征在于，其含有JE信号肽的核苷酸序列、以及编码寨卡病毒的膜蛋白prM和包膜糖蛋白E的核苷酸序列；其中，所述JE信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述编码寨卡病毒的膜蛋白prM和包膜糖蛋白E的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。


2.如权利要求1所述的重组穿梭质粒，其特征在于，所述重组穿梭质粒为pShuttle2-CMV-JE-prM-E。


3.一种复制缺陷型重组腺病毒载体，其是将权利要求1所述的重组穿梭质粒克隆入重组腺病毒载体而得，其中所述重组腺病毒载体为中国专利文献CN109797168A公开的重组腺病毒表达载体SAd23-L。


4.一种复制缺陷型重组腺病毒，其由权利要求3所述的复制缺陷型重组腺病毒载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗升学，刘博超，张攀丽，
申请(专利权)人：广州佰芮慷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44