一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR-NK细胞及用途制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR

【技术实现步骤摘要】
一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR
‑
NK细胞及用途


[0001]本专利技术涉及生物技术工程领域，具体涉及了一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR
‑
NK细胞及用途。

技术介绍

[0002]人巨细胞病毒（HCMV）感染是造血干细胞移植（HSCT）或实体器官移植（SOT）术后的常见并发症，被称为移植的巨魔。移植术后HCMV感染可直接引发肺炎、肝炎、胃肠疾病、脑炎和CMV综合征等，还会间接增加急慢性排斥反应和其他机会感染的发生率，严重影响预后。移植后HCMV感染的治疗一直是医学界关注的热点，目前大部分移植中心使用更昔洛韦、膦甲酸钠等抗病毒药物防治移植后HCMV感染，存在着骨髓抑制、肾毒性和易产生耐药等问题。以HCMV抗原多肽和CD3单抗和IL
‑
2等细胞因子体外诱导、扩增、制备细胞毒性T淋巴细胞（CMV
‑
CTL），联合抗病毒药物治疗移植后HCMV感染效果良好，然而，存在异体CTL细胞需要HLA配型，自体T细胞活性弱及细胞来源不足等问题，难以规模化应用于临床。

技术实现思路

[0003]为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供了一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR
‑
NK细胞及用途。
[0004]本专利技术所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：第一方面，一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体，其包含针对人巨细胞病毒的单链抗体和NKG2D胞外结构域、跨膜区、胞内信号转导区以及IL/>‑
15/IL
‑
15Rα细胞因子。
[0005]在本专利技术中，靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体还包含位于所述胞外抗原结合域和所述跨膜区之间的铰链域。
[0006]第二方面，一种核苷酸，其编码如上述的嵌合抗原受体。
[0007]第三方面，一种表达载体，其包括如上述的核苷酸。
[0008]在本专利技术中，所述载体是病毒载体。
[0009]在本专利技术中，所述病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。
[0010]第四方面，一种靶向人巨细胞病毒的CAR
‑
NK细胞，其用如上述的载体转导。
[0011]第五方面，一种靶向人巨细胞病毒的CAR
‑
NK细胞的构建方法，其包括以下步骤：（1）构建靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体，其包含针对人巨细胞病毒的单链抗体和NKG2D胞外结构域、跨膜区、胞内信号转导区以及IL
‑
15/IL
‑
15Rα细胞因子；（2）嵌合抗原受体转导NK细胞，步骤如下：
①
构建包含嵌合抗原受体的逆转录病毒载体：将步骤（1）的嵌合抗原受体通过NcoI和MluI酶切位点克隆到SFG.CNb30_opt.IRES.eGFP载体内；挑选单克隆进行酶切鉴定、测序鉴定，鉴定正确的质粒再转化感受态DH5α，扩增后提取质粒；质粒转染293A细胞，进行CAR蛋白表达鉴定；
②
逆转录病毒包装；
③
NK细胞分选和激活；用磁珠法分选得到NK细胞，与100Gy辐照后的CD48/4
‑
1BBL/mbIL
‑
21 K562细胞按照固定比例共培养激活，激活后第四天进行病毒感染；
④
病毒感染：感染前以PBS配制相应体积的RetroNectin溶液包被Non
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treated Tissue Culture 24孔板，500mL/孔，封口膜封口4℃包被过夜或37℃包被2小时，RetroNectin溶液回收后在
‑
20℃冻存，可冻融2次；包被后弃去RetroNectin，加入病毒液，Parafilm封闭孔板，离心2000g
×
9分钟，RT，收取激活后的NK细胞，以一定密度中烟，接种后再离心Parafilm封闭孔板，离心2000g
×
9分钟，RT。
[0012]第六方面，一种组合物，其包括如上述CAR
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NK细胞或由上述构建方法构建的CAR
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NK细胞，和药学上可接受的载体。
[0013]第七方面，上述细胞在制备治疗靶向人巨细胞病毒感染的药物中的用途。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：自然杀伤细胞（NK）具有广泛抗肿瘤与抗感染作用。本专利技术靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体NK细胞（CAR
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NK）可通过抗原
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抗体和多种受体
‑
配体作用，识别和杀伤HCMV感染细胞，而无需HLA配型，无细胞因子风暴，无移植物抗宿主病（GVHD）和神经毒性的问题。NKG2D 是NK 细胞的活化型受体，能识别表达在靶细胞表面的8 种不同配体。这些配体在正常细胞中不表达或者表达量极少，但当细胞受到感染或者发生癌变时，其表达量会大幅度上升，从而使其成为免疫治疗的通用靶点。另外，鉴于NK 细胞在体内存活时间短，引入IL
‑
15 R
ɑ
‑
IL
‑
15 融合蛋白基因，其结构包含IL
‑
15
ɑ
受体及IL
‑
15，能增强IL
‑
15 活性20 倍，药代动力学特性持续改善，进而增强CAR
‑
NK细胞的持久杀伤靶细胞能力。
[0015]本专利技术涉及的CAR结构一方面可以结合HCMV感染细胞，杀伤病毒感染细胞，同时也能发挥诱饵作用，竞争性结合病毒颗粒，抑制其感染作用。与CAR
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T疗法相比，CAR
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NK安全性更好，而且无需HLA配型，可开发作为货架型细胞治疗产品；CAR
‑
NK可以通过固有性免疫和适应性免疫两个途径，增强机体的抗病毒免疫力；按照本专利技术方法进行CAR基因转导，CAR在NK细胞中表达阳性率最高可达90%以上，分群明显，随着时间推移CAR表达比例稳定。
附图说明
[0016]图1是HCMV CAR的核心结构，包括信号肽（SS）
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NKG2D（和/或）
‑
连接肽（linker）
‑
铰链区（hinge）
‑
跨膜区（TM）
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胞内信号域41BB，CD3z
‑
P2A剪接肽（P2A）和IL
‑
15/IL
‑
15Rα；图2A. SFG.CNb30_opt.IRES.eGFP
‑
HCMV CAR重组质粒图谱，图2B. 电泳鉴定结果，从左到右分别是DL10,000DNA marker，未酶切质粒（10363bp）和KpnI限制性内切酶切得的目的条带（4316bp、3371bp、1476bp和1200bp）图2C. 测序鉴定的结果；图3 是逆转录病毒对NK细胞的感染效果（与pHAGE质粒包装的慢病毒感本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体，其特征在于，其包含针对人巨细胞病毒的单链抗体和NKG2D胞外结构域、跨膜区、胞内信号转导区以及IL
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15/IL
‑
15Rα细胞因子。2.根据权利要求1所述的靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体，其特征在于，还包含位于所述胞外抗原结合域和所述跨膜区之间的铰链域。3.一种核苷酸，其特征在于，其编码如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体。4.一种表达载体，其特征在于，其包括权利要求3所述的核苷酸。5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述载体是病毒载体。6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。7.一种靶向人巨细胞病毒的CAR
‑
NK细胞，其特征在于，其用权利要求4
‑
6任一项所述的载体转导。8.一种靶向人巨细胞病毒的CAR
‑
NK细胞的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：（1）构建靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体，其包含针对人巨细胞病毒的单链抗体和NKG2D胞外结构域、跨膜区、胞内信号转导区以及IL
‑
15/IL
‑
15Rα细胞因子；（2）嵌合抗原受体转导NK细胞，步骤如下：
①
构建包含嵌合抗原受体的逆转录病毒载体：将步骤（1）的嵌合抗原受体通过NcoI和MluI酶切位点克隆到SFG.CNb30_opt.IRE...

【专利技术属性】
技术研发人员：麦秋穗，何柏林，邓世楷，王聪，张玲，黎诚耀，
申请(专利权)人：广州佰芮慷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：