提高同源重组的方法和其组合物技术

本公开涉及用于提高同源重组效率的方法、试剂盒和组合物。具体地说，本公开涉及将用于DNA编辑的核酸切割实体引入难以转染的细胞中的方法。一般来说，不使用病毒载体将所述核酸切割实体引入细胞中。本公开还涉及通过下面的组合使用：启动子捕获，短同源臂、核定位信号，和/或将一种或多种DNA结合剂(与Cas9结合的TAL效应子域或截短的向导RNA)结合到特定位点，将DNA分子直接克隆到基因组中，从而置换或重构目标基因座处的染色质，和/或增加目标基因座的进一步酶促修饰的可及性。本文提供的方法和组合物尤其可用于基因组编辑和增强其中所涉及的酶促过程。

Methods and compositions for improving homologous recombination

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】提高同源重组的方法和其组合物相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年9月8日提交的美国临时申请第62/555,862号和2017年10月20日提交的美国临时申请第62/574,936号和2018年2月6日提交的美国临时申请第62/626,792号和2018年8月10日提交的美国临时申请第62/717,403号的优先权，所述申请与本申请一起被共同拥有，并且其全部内容以全文引用的方式明确并入本文，如同在本文中完整阐述一样。
本公开大体上涉及用于提高同源重组效率和准确度的组合物和方法。本公开进一步涉及通过将启动子捕获与短同源臂组合使用而将DNA分子直接克隆到基因组中的方法；以及所克隆的DNA分子的用途，例如在各种分析、组合物、试剂盒、细胞疗法中的用途；以及用于治疗性治疗的方法。
技术介绍
TALEN或CRISPR介导的基因组编辑工具的最新进展使研究人员能够有效地在哺乳动物基因组中引入双链断裂(DSB)。然后通过非同源末端连接(NHEJ)途径或同源定向修复(HDR)途径修复大部分DSB。在哺乳动物细胞中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种遗传改变细胞的方法，所述方法包含：/n(i)使细胞与核酸切割实体和供体DNA接触；/n(ii)在允许所述核酸切割实体和所述供体DNA被所述细胞吸收的条件下对所述细胞进行电穿孔；以及/n(iii)在非同源末端连接(NHEJ)抑制剂存在下培养所述细胞，从而形成基因改变的细胞；/n其中所述细胞是干细胞、免疫细胞、原代细胞，或悬浮生长的细胞。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170908 US 62/555,862;20171020 US 62/574,936;20181.一种遗传改变细胞的方法，所述方法包含：
(i)使细胞与核酸切割实体和供体DNA接触；
(ii)在允许所述核酸切割实体和所述供体DNA被所述细胞吸收的条件下对所述细胞进行电穿孔；以及
(iii)在非同源末端连接(NHEJ)抑制剂存在下培养所述细胞，从而形成基因改变的细胞；
其中所述细胞是干细胞、免疫细胞、原代细胞，或悬浮生长的细胞。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸切割实体是锌指蛋白、转录激活因子样效应物(TALE)、CRISPR复合物、阿格蛋白-核酸复合物、兆碱基大范围核酸酶或大范围核酸酶。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸切割实体包含转录激活因子样效应物(TALE)。


4.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸切割实体包含CRISPR复合物。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细胞是原代细胞。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述细胞是干细胞。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述干细胞是诱导型多能干细胞(iPSC)。


8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。


9.根据权利要求8所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞、B细胞、粒细胞、单核细胞、肥大细胞或嗜中性白细胞。


10.根据权利要求8所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述NHEJ抑制剂是DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)抑制剂、DNA连接酶IV抑制剂，或其组合。


12.根据权利要求11所述的方法，其中所述DNA-PK抑制剂是Nu7026(2-(4-吗啉基)-4H-萘并[1,2-b]吡喃-4-酮)、Nu7441(8-(4-二苯并噻吩基)-2-(4-吗啉基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮)、Ku-0060648(4-乙基-N-[4-[2-(4-吗啉基)-4-氧代-4H-1-苯并吡喃-8-基]-1-二苯并噻吩基]-1-哌嗪乙酰胺)、化合物401(2-(4-吗啉基)-4H-嘧啶并[2,1-a]异喹啉-4-酮)、DMNB(4,5-二甲氧基-2-硝基苯甲醛)、ETP45658(3-[1-甲基-4-(4-吗啉基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基苯酚)、LTURM34(8-(4-二苯并噻吩基)-2-(4-吗啉基)-4H-1,3-苯并噁嗪-4-酮)、UNC2170(3-溴-N-(3-(叔丁基氨基)丙基)苯甲酰胺)、Scr7(2,3-二氢-6,7-二苯基-2-硫代-4(1H)-蝶啶酮，6,7-二苯基-2-硫基-二氧四氢蝶啶)、咖啡因，和/或Pl103盐酸盐(3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚盐酸盐)。


13.根据权利要求12所述的方法，其中所述DNA-PK抑制剂是Nu7026、Ku0060648和/或Nu7441。


14.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞在5μM与60μM之间的Nu7026、100nM与1000nM之间的Ku0060648或0.3μM与2μM之间的Nu7441存在下培养。


15.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：章齐轩，梁锡权，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国;US