【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】提高同源重组的方法和其组合物
本公开涉及用于提高同源重组效率的方法、试剂盒和组合物。具体地说，本公开涉及通过将启动子捕获与短同源臂、核定位信号组合使用而将DNA分子直接克隆到基因组中和/或使一种或多种DNA结合剂(Cas9所结合的TAL效应域或经截短的向导RNA)结合到特定位点、借此置换或重构目标基因座处的染色质且/或以此增强目标基因座发生进一步酶促修饰的可及性的方法。本文提供的方法和组合物尤其可用于基因组编辑和增强其中所涉及的酶促过程。
技术介绍
TALEN或CRISPR介导的基因组编辑工具的最新进展使研究人员能够有效地在哺乳动物基因组中引入双链断裂(DSB)。然后通过非同源末端连接(NHEJ)途径或同源定向修复(HDR)途径修复大部分DSB。在哺乳动物细胞中，NHEJ途径是主要的且容易出错。但是，HDR途径允许通过使用姐妹染色单体或外源DNA分子进行精确的基因组编辑。已经进行了许多尝试来提高HDR效率，但是效率仍然较低。举例来说，利用siRNA同时阻断KU70与DNA连接酶IV的基因表现使HDR效率提高4到5倍。参见Chu等人，《自然·生物技术(Nat.Biotechnol.)》33：543-548(2015)。使用Cas9切口酶和长DNA供体模板使得人类胚胎干细胞(hESC)的HDR效率达到5％。参见Rong等人，“使用CRISPR/Cas9切口酶及长DNA供体模板在人类胚胎干细胞中进行同源重组(HomologousrecombinationinhumanembryonicstemcellsusingCRISP...
【技术保护点】
1.一种改变存在于细胞内的内源核酸分子的方法，所述方法包含将供体DNA分子引入所述细胞中，/n其中所述供体DNA分子可操作地连接到一个或多个细胞内靶向部分，所述细胞内靶向部分能够使所述供体DNA分子定位到所述内源核酸分子在所述细胞中所处的位置。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170908 US 62/555,862;20171005 US 62/568,661;20171.一种改变存在于细胞内的内源核酸分子的方法，所述方法包含将供体DNA分子引入所述细胞中，
其中所述供体DNA分子可操作地连接到一个或多个细胞内靶向部分，所述细胞内靶向部分能够使所述供体DNA分子定位到所述内源核酸分子在所述细胞中所处的位置。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述内源核酸分子在所述细胞中所处的所述位置存在于细胞核、线粒体或叶绿体中。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个细胞内靶向部分是核定位信号。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体DNA分子的长度为约25至约8,000个核苷酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体DNA分子是单链的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体DNA分子在一个或多个末端的50个核苷酸内具有一个或多个核酸酶抗性基团。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述核酸酶抗性基团选自由以下组成的组：硫代磷酸酯基团、氨基、2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核苷酸、2′-脱氧核苷酸、5-C-甲基核苷酸，或其组合。
8.根据权利要求1所述的方法，所述供体DNA是双链的或部分双链的。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体DNA分子含有正向可选标记物和负向可选标记物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述负向可选标记物是编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的核酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体DNA分子具有序列与存在于所述细胞中的目标基因座互补的两个区域。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述可选标记物位于所述供体DNA分子的两个具有序列互补性的区域之间。
13.根据权利要求1所述的方法，其中使所述细胞与以下中的一种或多种接触：
(1)一个或多个核酸切割实体，
(2)一种或多种编码核酸切割实体的一种或多种组分的核酸分子，
(3)一种或多种DNA结合调节增强剂，
(4)一种或多种编码DNA结合调节增强剂的一种或多种组分的核酸分子，或
(5)一种或多种非同源末端连接(NHEJ)抑制剂。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述一种或多种非同源末端连接(NHEJ)抑制剂是DNA依赖性蛋白激酶抑制剂。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述一种或多种核酸切割实体中的一种或多种选自由以下组成的组：
(1)锌指核酸酶
(2)TAL效应物核酸酶，和
(3)CRISPR复合物。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述一种或多种DNA结合调节增强剂中的一种或多种选自由以下组成的组：
(1)锌指蛋白，
(2)TALE蛋白，以及
(3)CRISPR复合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述TALE蛋白不具有异源核酸酶结构域。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述CRISPR复合物包含dCas9蛋白。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述一种或多种DNA结合调节增强剂中的一种或多种被设计为在所述目标基因座的50个核苷酸内结合。
20.一种TALE蛋白，其包含氨基酸：图46的氨基酸811-830，其中位置815-816和824-825处的氨基酸可以是Gly-Ser或Gly-Gly。
21.根据权利要求20所述的TALE蛋白，其包含氨基酸：图46的氨基酸810-1029，其中位置1022-1023处的氨基酸可以是Gly-Ser或Gly-Gly。
22.根据权利要求20所述的TALE蛋白，其包含图46的氨基酸：氨基酸752-1021。
23.一种TALE蛋白，其包含氨基酸：图47的氨基酸20-27、30-107和111-165，其中位置28-29处的氨基酸是Gly-Ser或Gly-Gly且其中位置108-110处的氨基酸是Arg-Gly-Ala或Gln-Trp-Ser。
24.一种TALE蛋白，其包含氨基酸：图47的氨基酸821-826和829-840，其中位置827-828处的氨基酸是Gly-Ser或Gly-Gly。
25.根据权利要求24所述的TALE蛋白，其包含对应于图47的氨基酸。
26.根据权利要求24所述的TALE蛋白，其包含含有4至25个重复单元的重复区域。
27.一种对细胞中的细胞内核酸进行工程改造的方法，所述方法包含将根据权利要求23所述的TALE蛋白或编码根据权利要求23所述的TALE蛋白的核酸引入所述细胞中。
28.根据权利要求27所述的方法，进一步包含将供体核酸分子引入所述细胞中，其中所述供体核酸分子具有序列与位于所述目标基因座的50个核苷酸内的核酸同源的一个或多个区域。
29.一种Cas9蛋白，其包含两个或更多个双分型核定位信号。
30.根据权利要求29所述的Cas9蛋白，其中所述两个或更多个双分型核定位信号定位于一个或多个末端的二十个氨基酸内。
31.根据权利要求29所述的Cas9蛋白，其中所述两个或更多个双分型核定位信号个别地定位于所述蛋白质的N端和C端的二十个氨基酸内。
32.根据权利要求29所述的Cas9蛋白，其中所述两个或更多个双分型核定位信号包含不同的氨基酸序列。
33.根据权利要求29所述的Cas9蛋白，进一步包含一个或多个单分型核定位信号。
34.根据权利要求29所述的Cas9蛋白，其进一步包含亲和标签。
35.一种对细胞中的细胞内核酸进行工程改造的方法，所述方法包含将根据权利要求29所述的Cas9蛋白或编码根据权利要求29所述的Cas9蛋白的核酸引入所述细胞中，其中所述Cas9蛋白被设计成结合到所述细胞内的目标基因座。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述Cas9蛋白是以Cas9/gRNA复合物形式引入所述细胞中。
37.根据权利要求35所述的方法，进一步包含将供体核酸分子引入所述细胞中，其中所述供体核酸分子具有序列与位于所述目标基因座的50个核苷酸内的核酸同源的一个或多个区域。
38.一种使细胞群内的细胞内核酸分子在裂解位点发生同源重组的方法，所述方法包含：
(a)使所述细胞内核酸分子在所述裂解位点产生双链断裂，以产生裂解的核酸分子，以及
(b)使所述裂解的核酸分子与供体核酸分子接触，其中所述供体核酸分子具有至少十个与位于所述裂解位点每一侧的100个碱基对内的核酸同源的核苷酸或碱基对，
其中所述细胞群内的至少95％细胞经历所述供体核酸分子在所述裂解位点的同源定向修复。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述供体核酸分子含有选择标记物或报道基因，在同源定向修复之后，所述选择标记物或报道基因可操作地连接到存在于所述细胞内核酸分子中的启动子。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述供体核酸分子与一个或多个核定位信号连接，所述核定位信号允许所述供体核酸分子定位到所述细胞群的细胞核。
41.根据权利要求38所述的方法，使所述细胞群与以下中的一种或多种接触：
(1)一个或多个核酸切割实体，
(2)一种或多种编码核酸切割实体的一种或...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁锡权，R·波特，L·彭，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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