使细菌能够通过葡萄糖依赖性生存力特异性靶向实体肿瘤的核酸系统技术方案

提供了一个核酸系统，其被引入细菌菌株以产生在实体肿瘤中生长但不在非肿瘤组织中生长的基因工程化细菌菌株，所述核酸系统包含：编码毒素基因的第一DNA片段，所述毒素基因表达杀死所述基因工程化细菌菌株的毒素；编码解毒剂基因的第二DNA片段，所述解毒剂基因表达使所述毒素无效的解毒剂；第一启动子，其控制所述解毒剂基因的转录，使得葡萄糖抑制所述解毒剂基因的转录；以及第一组成型启动子，其引起毒素基因的组成型表达；其中所述第二DNA片段在实体肿瘤中转录，但在非肿瘤组织中不转录。

Nucleic acid system that enables bacteria to target solid tumors specifically through Glucose dependent survivability

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使细菌能够通过葡萄糖依赖性生存力特异性靶向实体肿瘤的核酸系统
本专利技术涉及核酸系统。特别地，本专利技术涉及赋予细菌靶向实体肿瘤能力的核酸系统。
技术介绍
大多数抗肿瘤药物针对所有活跃分裂的细胞起作用，导致严重的甚至致命的副作用。当全身施用时，靶向疗法必须能够区分肿瘤与非肿瘤组织，以便治疗原发性和播散性肿瘤。以前的靶向治疗依赖于非生物药物。当全身递送时，非生物药物在血流中显著稀释，仅有一小部分可用于肿瘤。此外，非生物药物依赖于肿瘤血管来递送，因此不能有效地扩散至血管化差和低氧的肿瘤组织。因此，在过去的几十年中，已经评估了各种专性或兼性厌氧菌在靶向肿瘤方面的安全性和有效性，所述专性或兼性厌氧菌能够进行递送后繁殖并偏爱血管化不良的肿瘤组织。这些肿瘤靶向的厌氧菌如梭状芽孢杆菌和沙门氏菌可作为肿瘤杀伤剂的载体，实现肿瘤的靶向治疗。在一些情况下，发现工程化专性厌氧菌显示增加的肿瘤选择性。尽管有这些进展，但肿瘤靶向细菌的临床应用仍然远非现实，因为它们的肿瘤特异性不足。鉴于对具有改善肿瘤特异性的靶向治疗的需求，非常需要破坏肿瘤但使正常组织保持完整的肿瘤靶向系统、药剂和方法。
技术实现思路
一个示例性实施方案是引入细菌菌株以产生基因工程化细菌菌株的核酸系统。所得到的基因工程化细菌菌株在实体肿瘤中生长，但不在非肿瘤组织中生长。所述核酸系统包括第一DNA片段、第二DNA片段、第一启动子和第一组成型启动子。第一DNA片段编码毒素基因，该毒素基因表达杀死基因工程化细菌菌株的毒素。第二DNA片段编码解毒剂基因，其表达使毒素无效的解毒剂。第一启动子控制解毒剂基因的转录，使得葡萄糖抑制解毒剂基因的转录。第一组成型启动子引起毒素基因的组成型表达。第二DNA片段在实体肿瘤中转录，但在非肿瘤组织中不转录。本文讨论了其他示例性实施例。附图说明图1A显示了根据一个示例性实施方案将细菌靶向低葡萄糖环境的毒素-解毒剂遗传系统。图1B显示了根据一个示例性实施方案，使用CcdB作为毒素、CcdA作为解毒剂，构建将大肠杆菌靶向低葡萄糖环境的核酸系统的示意图。图1C显示了根据一个示例性实施方案的药物递送系统，其包括将抗癌药物递送至实体肿瘤的基因工程化细菌。所述抗癌药物包括但不限于由工程化细菌产生的抗癌分子或化合物或者由细菌表达并能够触发抗癌免疫应答的抗原。图1D显示了根据一个示例性实施方案在具有0mM至4mM不同葡萄糖浓度的M63琼脂上划线以寻找在葡萄糖存在下不能生长但在葡萄糖不存在下生长的克隆。图2A显示了根据一个示例性实施方案，在静脉注射细菌(107/小鼠)后15天，基因工程化菌株JY1和JY6和未修饰的命名为MG1655的野生型大肠杆菌菌株在Bagg白化体/c(BALB/c)小鼠的CT26(鼠结肠直肠癌细胞系)肿瘤中的定殖。图2B显示了根据一个示例性实施方案，在静脉注射细菌(107/小鼠)后15天，细菌JY1、JY6和MG1655菌株在CT26肿瘤BALB/c小鼠肝脏中的定殖。图2C显示了根据一个示例性实施方案，在静脉注射细菌(107/小鼠)后15天，细菌菌株JY1、JY6和MG1655在具有CT26肿瘤的BALB/C小鼠肝脏中定殖的百分比。图2D显示了根据一个示例性实施例，在静脉注射细菌(107/小鼠)后7天，细菌菌株JY1、JY6和MG1655在具有HCT116(人结肠直肠癌细胞系)肿瘤的裸鼠的肿瘤中的定殖。图2E显示了根据一个示例性实施方案，在静脉注射细菌(107/小鼠)后7天，细菌菌株JY1、JY6和MG1655在具有HCT116肿瘤的裸鼠肝脏中的定殖。图2F显示了根据一个示例性实施方案，在静脉注射细菌(107/小鼠)后7天，细菌菌株JY1、JY6和MG1655在具有HCT116肿瘤的裸鼠肝脏中定殖的百分比。图3A显示了根据一个示例性实施方案，细菌菌株JYH1和SH1hly在携带皮下SW480(人结肠直肠癌细胞系)肿瘤的裸鼠的肝脏和脾脏中的定殖。图3B显示了根据一个示例性实施方案，在携带皮下SW480肿瘤的裸鼠中被细菌菌株JYH1和SH1hly感染的肝脏和脾脏的百分比。图3C显示了根据一个示例性实施方案用细菌菌株SH1hly处理的小鼠中形成的肝脓肿。图3D显示了根据一个示例性实施方案，来自携带皮下SW480肿瘤的裸鼠的苏木精和伊红(H&E)染色的肝脏切片的显微图像，所述裸鼠用磷酸盐缓冲盐水(PBS)、菌株SH1hly和JYH1处理。图4显示了根据一个示例性实施方案静脉注射JYH1菌株对免疫活性BALB/c小鼠CT26肿瘤的靶向效果。图5显示了根据一个示例性实施方案，通过在葡萄糖缺乏区选择性存活和生长来构建靶向实体肿瘤的基因工程化细菌菌株的方法。图6A显示了根据一个示例性实施方案，大肠杆菌SH1和大肠杆菌MG1655对SW480和HCT116细胞的体外细胞毒性作用。图6B显示了根据一个示例性实施方案，大肠杆菌SH1和大肠杆菌MG1655对ASPC-1、Mia-capa-2和panc-1细胞的体外细胞毒性作用。图7A显示了根据一个示例性实施例的静脉注射的大肠杆菌JYH1对HCT116肿瘤在裸鼠中生长的抑制作用。图7B显示了根据一个示例性实施方案的静脉注射大肠杆菌JYH1对SW480肿瘤在裸鼠中生长的抑制作用。图7C显示了根据一个示例性实施方案，在0-55天内将PBS静脉注射到小鼠中治疗SW480肿瘤的代表性照片。图7D显示了根据一个示例性实施方案，在0-90天内将JYH1静脉注射到小鼠中治疗SW480肿瘤的代表性照片。具体实施方式示例性实施方案涉及一种核酸系统。将所述核酸系统导入细菌菌株，以使基因工程化细菌菌株靶向实体肿瘤，但使正常组织保持完整。低氧(hypoxia)是肿瘤微环境的特征之一，最常用于将细菌靶向实体肿瘤。然而，严格靶向低氧的专性厌氧菌局限于实体肿瘤的坏死区，而兼性厌氧菌定殖于整个实体肿瘤，但由于其对低氧靶向的不严格而感染正常组织。根据本专利技术的实施例通过向细菌中引入核酸系统解决了这些技术问题，所述核酸系统通过调节细菌的葡萄糖依赖性存活力来改善细菌的肿瘤特异性。图1A显示了包括组成型表达的毒素编码基因和在葡萄糖抑制型启动子控制下的解毒剂编码基因的核酸系统100。根据一个示例性实施方案，核酸系统赋予细菌靶向低葡萄糖环境的能力。毒素解毒剂遗传系统使细菌能够在葡萄糖缺乏的环境中选择性生长，但在葡萄糖存在下死亡。由于葡萄糖缺乏是实体肿瘤微环境的特征，因此，当全身应用时，配备有所述核酸系统的细菌可以特异性靶向实体肿瘤。肿瘤细胞通常由于快速细胞生长和过量葡萄糖消耗以及血液供应不足而缺乏葡萄糖。假定1g组织为1ml，肿瘤组织中葡萄糖浓度为0.123-0.424mM，正常组织中葡萄糖浓度为1.22-1.29mM。毒素-解毒剂核酸系统使细菌能够在低葡萄糖环境下选择性生长。核酸系统赋予细菌在低葡萄糖条件下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸系统，其被引入细菌菌株中以产生在实体肿瘤中生长但不在非肿瘤组织中生长的基因工程化细菌菌株，所述核酸系统包含：/n编码毒素基因的第一DNA片段，所述毒素基因表达杀死所述基因工程化细菌菌株的毒素；/n编码解毒剂基因的第二DNA片段，所述解毒剂基因表达使所述毒素无效的解毒剂；/n第一启动子，其控制所述解毒剂基因的转录，使得葡萄糖抑制所述解毒剂基因的转录；以及/n第一组成型启动子，其引起毒素基因的组成型表达；/n其中所述第二DNA片段在实体肿瘤中转录，但在非肿瘤组织中不转录。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸系统，其被引入细菌菌株中以产生在实体肿瘤中生长但不在非肿瘤组织中生长的基因工程化细菌菌株，所述核酸系统包含：
编码毒素基因的第一DNA片段，所述毒素基因表达杀死所述基因工程化细菌菌株的毒素；
编码解毒剂基因的第二DNA片段，所述解毒剂基因表达使所述毒素无效的解毒剂；
第一启动子，其控制所述解毒剂基因的转录，使得葡萄糖抑制所述解毒剂基因的转录；以及
第一组成型启动子，其引起毒素基因的组成型表达；
其中所述第二DNA片段在实体肿瘤中转录，但在非肿瘤组织中不转录。


2.权利要求1所述的核酸系统，其中所述实体肿瘤的特征在于葡萄糖浓度低于0.424mM。


3.根据前述权利要求中任一项所述的核酸系统，其中所述非肿瘤组织的特征在于葡萄糖浓度高于1.22mM。


4.根据前述权利要求中任一项所述的核酸系统，其中所述第一启动子位于所述第二DNA片段的紧接上游。


5.根据前述权利要求中任一项所述的核酸系统，其中所述第一组成型启动子位于所述第一DNA片段的紧接上游。


6.根据前述权利要求中任一项所述的核酸系统，其中所述第一启动子选自由lac启动子、gltA启动子、sdhADC启动子和tnaB启动子组成的组。


7.根据前述权利要求中任一项所述的核酸系统，其中毒素和解毒剂的对选自由CcdB-CcdA对、AvrRxo1-Arc1对、Hha-TomB对和PaaA2-ParE2对组成的组。


8.根据前述权利要求中任一项所述的核酸系统，其中所述第一DNA片段如SEQIDNo.1所示，并且所述第二DNA片段如SEQIDNo.2所示。


9.根据前述权利要求中任一项的核酸系统，其中所述第一启动子如SEQIDNo.3所示。


10.根据前述权利要求中任一项所述的核酸系统，其还包括：
由5-6个核苷酸组成的随机序列，并且其取代了基因工程化细菌菌株的原始5-6个核苷酸，其位于所述第二DNA片段的紧接上游。


11.根据权利要求10所述的核酸系统，其中所述随机序列是GCCTT或TGTCT。


12.根据前述权利要求中任一项所述的核酸系统，其还包括：
编码氯霉素抗性盒的第三DNA片段，
其中第三DNA片段如SEQIDNo.4所示。


13.根据前述权利要求中任一项所述的核酸系统，其中所述细菌菌株选自由大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌组成的组。


14.根据前述权利要求中任一项所述的核酸系统，其中所述细菌菌株是大肠杆菌MG1655。


15.根据前述权利要求中任一项所述的核酸系统，其中所述核酸系统如SEQIDNo.7或SEQIDNo.8所示。


16.一种核酸系统，其被引入细菌菌株中以产生在实体肿瘤中生长但不在非肿瘤组织中生长的基因工程化细菌菌株，所述核酸系统包含：
编码毒素基因的第一DNA片段，所述毒素基因表达杀死所述基因工程化细菌菌株的毒素；
编码解毒剂基因的第二DNA片段，所述解毒剂基因表达使毒素无效的解毒剂；
第二启动子，其控制毒素基因的转录，使得葡萄糖诱导毒素基因的转录；以及
第二组成型启动子，其引起所述解毒剂基因组成型表达的；
其中所述第一DNA片段在非肿瘤组织中转录，但在实体肿瘤中不转录。


17.根据权利要求16所述的核酸系统，其中所述实体肿瘤的特征在于葡萄糖浓度低于0.424mM。


18.根据权利要求16-17中任一项所述的核酸系统，其中所述非肿瘤组织的特征在于葡萄糖浓度高于1.22mM。


19.根据权利要求16-18中任一项所述的核酸系统，其中所述第二启动子位于所述第一DNA片段的紧接上游。


20.根据权利要求16-19中任一项所述的核酸系统，其中所述第二组成型启动子位于所述第二DNA片段的紧接上游。
...

【专利技术属性】
技术研发人员：金叶，
申请(专利权)人：新实有限公司，
类型：发明
国别省市：中国香港;81