一种改进的PB转座子系统及其用途技术方案

本发明专利技术涉及改进的PB转座子系统及其用途。具体而言，本发明专利技术提供一种核酸构建体，其依次含有控制PiggyBac转座酶表达的启动子、PiggyBac转座酶编码序列、PiggyBac转座子5’末端重复序列、任选的polyA加尾信号序列1、多克隆插入位点、polyA加尾信号序列2和PiggyBac转座子3’末端重复序列。使用本发明专利技术的核酸构建体构建的重组载体具有明显提高的整合效率。

An improved Pb transposition subsystem and its application

【技术实现步骤摘要】
一种改进的PB转座子系统及其用途
本专利技术涉及一种改进的PB转座子系统及其用途。
技术介绍
外源基因在宿主细胞内的表达形式可分为瞬时表达与稳定表达，其中稳定表达是指：(1)外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。重组基因的稳定表达水平一般要比短暂表达低1～2个数量级。(2)宿主细胞虽经过多次传代或条件变化，但表达水平仍然保持稳定。鉴于稳定表达能随着细胞分裂维持外源基因长时间持续表达，在离体细胞修饰(exvivo)，如转基因嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，CAR-T)治疗研究中具有重要意义。CAR-T细胞能特异识别并高效杀伤表达特定细胞表面抗原的肿瘤细胞，已取得显著的临床疗效。如针对CD19的CAR-T能高效杀伤表达CD19表面抗原的B细胞淋巴瘤，对晚期难治性B细胞淋巴瘤患者，有效缓解率达到90％(MaudeSL,FreyN,ShawPA,AplencR,BarrettDM,BuninNJ,ChewA,GonzalezVE,ZhengZ,LaceySF,MahnkeYD,MelenhorstJJ,RheingoldSR,ShenA,TeacheyDT,LevineBL,JuneCH,PorterDL,GruppSA.，ChimericantigenreceptorTcellsforsustainedremissionsinleukemia，NEnglJMed.2014；371(16):1507-17)。为实现外源基因在宿主细胞内的稳定表达，常用的载体系统包括：1.逆转录病毒系统：能有效感染宿主细胞，并介导外源基因表达框的基因组高效整合，但其装载容量有限，且重组病毒颗粒制备工艺复杂。2.真核表达质粒系统：制备工艺相对简单，但其通过随机DNA重组的方式插入宿主基因组，整合效率极低。3.转座子系统：采用质粒系统，制备工艺相对简单，通过转座酶将外源基因整合入基因组，整合效率相对较低。最早应用的哺乳动物转座子系统是源于鱼类的“睡美人”转座子(SleepingBeauty)，但是“睡美人”转座子存在过量抑制效应和携带片段偏小(5kb左右)等缺陷，使其在转基因应用上受到限制。来源于鳞翅目昆虫的piggyBac(PB)转座子是目前哺乳动物中活性最高的转座子。其宿主范围极其广泛，从单细胞生物到哺乳动物都能够发挥作用；能够携带较大的外源DNA片段，当转座片段在14kb以内时，转座效率不会显著下降。PB转座子主要采取“cut-paste”机制发生转座，在转座片段被切除后不会在原位点留下印迹(footprint)，基因组可以实现切除后精确修复，在可逆转基因的应用中具有重要作用。此外，PB转座酶可塑性高，通过与其它功能蛋白融合或改变转座酶的功能区域，不仅能够改变转座酶的活性和作用方式，也可以提高外源基因转座的靶向性。近年来，通过密码子优化、特定位点氨基酸定点突变、相应核定位标签的引入等，使PB在哺乳动物细胞内的整合效率进一步提高，使得该系统在基因组研究、基因治疗、细胞治疗、干细胞诱导和诱导后分化等领域获得了广泛的应用。传统的PB转座子系统采用供体质粒(在外源基因表达框两端含有可以为PB整合酶识别的末端重复序列)和转座酶辅助质粒(提供PB转座酶)构成的二元转座系统。在该二元转座系统中，为实现外源基因表达框的有效整合，必须满足两个质粒被转染到同一细胞内，这在转染过程中只有一部分细胞能够实现(其它细胞要么一个质粒也没成功转染，要么只转染了其中一个质粒，都不能实现有效整合)，一定程度上降低了整合效率。同时，由于PB转座子系统采用完全可逆的“cut-paste”形式发生，只要整合酶维持表达，其仍具有将已整合入基因组的外源基因表达框重新剪切掉的可能，导致基因组不稳定，且实际上降低了整合效率。为提高PB转座子系统的整合效率，一种策略是将供体质粒与转座酶辅助质粒纳入同一质粒，同时设置转座酶的自我失活(Self-inactivating)机制，保证在外源基因实现整合后，转座酶的表达能被及时关闭。例如，使PB表达框与外源基因表达框同向放置，并共用同一个PolyA加尾信号序列，一旦外源基因表达框被从质粒上切除并整合到基因组，PB表达框将缺损PolyA加尾信号序列，导致转录的mRNA不稳定而被快速降解，PB的表达被关闭(ChakrabortyS,JiH,ChenJ,GersbachCA,LeongKW，VectormodificationstoeliminatetransposaseexpressionfollowingpiggyBac-mediatedtransgenesis，SciRep.2014；4:7403)。PB转座子系统的另一个缺陷在于：其野生型的5’和3’反向末端重复序列(InvertedTerminalRepeats,ITR)的长度都在700bp以上，总长度约1.5kb。这些序列是外源基因通过转座整合到基因组中所必需的。然而一旦转座完成，这1.5kb的序列将不会再发挥功能，并且由于其本身就有启动子和增强子活性，还可能潜在地增加细胞转化的风险。此外较长的ITR序列还增加了转染时载量的负担，影响了转染效率。而缩短ITR长度会导致转座效率的显著下降(ZhuangL,WeiH,LuC,ZhongB.，TherelationshipbetweeninternaldomainsequencesofpiggyBacanditstranspositionefficiencyinBmNcellsandBombyxmori.，ActaBiochimBiophysSin(Shanghai)2010；42:426–431；LiX,HarrellRA,HandlerAM,BeamT,HennessyK,FraserJr.MJ.，piggyBacinternalsequencesarenecessaryforefficienttransformationoftargetgenomes，InsectMolBiol2005；14:17–30.)。Solodushko等人报道了一种最小化的PB转座系统末端重复序列(minTR)，去除了野生型ITR的大部分序列，其中5’minTR长35bp，3’minTR长63bp，长度大大小于野生型5’和3’ITR，但仅有minTR自身的存在无法完成转座过程。全长ITR的序列，即使是在转座体系以外的载体中存在，也仍然是转座发生所必需的元件(SolodushkoV,BitkoV,FoutyB，MinimalpiggyBacvectorsforchromatinintegration，GeneTher.2014Jan；21(1):1-9)。这种最小化的PB转座系统末端重复序列虽然能够显著减少ITR序列整合到靶细胞基因组中的长度、从而减少靶细胞转化的风险，但由于全长ITR序列仍然需要在整个体系中的某个地方存在且需要通过诸如病毒或电转等方法被一起导入细胞，因此需要被转入细胞的核酸负载仍然较大，转染效率也仍然会受到影响。我们在前期提供了一种高效安全的转座子整合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸构建体，其含有依次连接的控制PiggyBac转座酶表达的启动子、PiggyBac转座酶编码序列、PiggyBac转座子5’末端重复序列、任选的polyA加尾信号序列1、多克隆插入位点、polyA加尾信号序列2和PiggyBac转座子3’末端重复序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种核酸构建体，其含有依次连接的控制PiggyBac转座酶表达的启动子、PiggyBac转座酶编码序列、PiggyBac转座子5’末端重复序列、任选的polyA加尾信号序列1、多克隆插入位点、polyA加尾信号序列2和PiggyBac转座子3’末端重复序列。


2.如权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，
所述PiggyBac转座子5’末端重复序列为截短的PiggyBac转座子5’末端重复序列；和/或
所述PiggyBac转座子3’末端重复序列为截短的PiggyBac转座子3’末端重复序列；和/或
所述核酸构建体不含有所述polyA加尾信号序列1；和/或
所述核酸构建体中除所述5’末端重复序列和3’末端重复序列所含的TTAA序列以外的其它TTAA序列被删除。


3.如权利要求1-2中任一项所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体具有以下一项或多项特征：
(1)所述控制PiggyBac转座酶表达的启动子选自CMV启动子、SV40启动子、PGK启动子和鸡β-actin启动子，优选为CMV启动子，更优选地，所述启动子的序列如SEQIDNO:1所示；
(2)所述PiggyBac转座酶编码序列含核定位信号，所述核定位信号选自c-myc核定位信号和SV40核定位信号；优选地，所述PiggyBac转座酶编码序列如SEQIDNO:2所示；优选地，所述核定位信号位于所述PiggyBac转座酶编码序列的N端；
(3)所述PiggyBac转座子5’末端重复序列如SEQIDNO:3所示；
(4)所述polyA加尾信号序列1如SEQIDNO:4所述；
(5)所述多克隆插入位点如SEQIDNO:5所示；
(6)所述polyA加尾信号序列2为SV40polyA加尾信号序列；优选地，所述polyA加尾信号序列2如SEQIDNO:6所示；和
(7)所述PiggyBac转座子3’末端重复序列如SEQIDNO:7所示。


4.如权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体选自：
(a)含有依次连接的SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、任选的SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的核酸构建体；
(b)在(a)所示的核酸构建体的基础上删除了除SEQIDNO:3和SEQIDNO:7所含TTAA以外的其它TTAA的核酸构建体。


5.如权利要求1-4中任一项所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的多克隆位点可操作地插入了一个或多个相同或不同的表达框，或所述多克隆位点被替换为一个或多个相同或不同的表达框。


6.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1-5中任一项所述的核酸构建体；
优选地，所述重组载体为重组克隆载体、重组真核表达质粒或者重组病毒载体；优选地，所述重组克隆载体为权利要求1-5中任一项所述的核酸构建体与pUC18、pUC19、pMD18-T、pMD19-T、pGM-T载体、pUC57、pMAX或pDC315系列载体经重组得到的重组载体；所述重组表达载体为权利要求1-5中任一项所述的核酸构建体与pCDNA3系列载体、pCDNA4系列载体、pCDNA5系列载体、pCDNA6系列载体、pRL系列载体、pUC57载体、pMAX载体或pDC315系列载体经重组得到的重组表达载体；所述重组病毒载体为重组腺病毒载体、重组腺相关病毒载体、重组逆转录病毒载体、重组单纯疱疹病毒载体或重组痘苗病毒载体。


7.含有权利要求1-5中任一项所述的核酸构建体或权利要求6或7所述的重组载体的重组细胞；优选地，所述重组宿主细胞为重组哺乳动物细胞，例如重组原代培养T细胞、Jurkat细胞、K562细胞、胚胎干细胞、肿瘤细胞、HEK293细胞或CHO细胞。


8.一种制备基因组整合有外源基因表达框的细胞的方法，所述方法包括将权利要求6或7所述的重组载体转染到感兴趣的细胞中，以及培养转染的细胞的步骤；优...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘韬，刘辉，金华君，王超，何周，何江川，吴碧寒，刘天怡，钱其军，
申请(专利权)人：上海细胞治疗集团有限公司，上海细胞治疗研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31