【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多重测定相关申请的交叉引用本申请要求2017年5月16日提交的美国临时专利申请号62/507,169的权益，将其公开内容通过引用以其整体特此并入。关于联邦资助的研究或开发的声明本专利技术是在由美国国家科学基金会(NationalScienceFoundation)授予的基金号1448764和1632576以及与美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)签订的合同HHSN271201600006C、HHSN271201500028C和HHSN271201600021C下在政府支持下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。
技术介绍
确定对内部或外部刺激的细胞反应需要可视化并且监测关键的参与者和途径。当前可视化此类反应的方法效率低下、成本高并且仅提供快照。例如，传统上使用体内临床前动物模型进行药物发现和/或候选药物的毒理学评估，所述体内临床前动物模型是低通量的、成本高、对人体毒性的预测性不足，并且对化合物毒性的机制所提供的了解甚少。这些传统方法的通量远远不及新化学品产生的速度，无论它们是出于药学上的、农业上的还是其他目的(如营养品、化妆品、个人护理等)开发的化合物。对这些新化学品的功效或可能对人体健康构成的风险评估的需求要求开发新的筛选工具，其可以在与每周评估数十万种化合物兼容的通量下提供与此类化合物相关的机制的有意义的了解。理想地，新的筛选工具将能够精确定位特定的化学品对细胞生理学的哪些方面产生干扰，并且测量所产生的细胞反应。这些需求可以通过适当配置的活细胞方法来解决，这是本专利技术的重...
【技术保护点】
1.一种多顺反子报告载体，其包含：/n与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含两个或更多个顺反子，并且其中所述开放阅读框在细胞中的表达产生来自每个顺反子的分离的组分多肽产物；/n其中每个顺反子包含多克隆位点(MCS)和编码报告载体的核酸，并且其中每个顺反子编码不同的报告多肽；并且/n其中插入所述两个或更多个多克隆位点中的编码多肽的两种或更多种核酸的表达是本质上化学计量的。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170516 US 62/507,1691.一种多顺反子报告载体，其包含：
与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含两个或更多个顺反子，并且其中所述开放阅读框在细胞中的表达产生来自每个顺反子的分离的组分多肽产物；
其中每个顺反子包含多克隆位点(MCS)和编码报告载体的核酸，并且其中每个顺反子编码不同的报告多肽；并且
其中插入所述两个或更多个多克隆位点中的编码多肽的两种或更多种核酸的表达是本质上化学计量的。
2.根据权利要求1所述的多顺反子报告载体，其中所述顺反子通过编码一种或多种自切割肽和/或一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)的核酸彼此分开。
3.根据权利要求2所述的多顺反子报告载体，其中所述一种或多种自切割肽是病毒自切割肽。
4.根据权利要求3所述的多顺反子报告载体，其中所述一种或多种病毒自切割肽是一种或多种2A肽。
5.根据权利要求4所述的多顺反子报告载体，其中一种或多种2A肽是T2A肽、P2A肽、E2A肽或F2A肽。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述报告多肽还包含一种或多种核酸，其编码在一种或多种所述报告多肽与一种或多种所述自切割肽之间的肽接头。
7.根据权利要求6所述的多顺反子报告载体，其中所述肽接头包含序列Gly-Ser-Gly。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述报告多肽是荧光报告多肽。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的多顺反子报告载体，其中每个顺反子的所述报告多肽选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子和第二顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸和编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码病毒切割肽的核酸分开。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子和第三顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸和编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，并且所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子、第三顺反子和第四顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸、编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开，所述第三顺反子和所述第四顺反子通过编码第三病毒切割肽的核酸分开。
13.根据权利要求1-9中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子、第三顺反子和第四顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸、编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开，所述第三顺反子和所述第四顺反子通过编码IRES的核酸分开。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述载体还包含一种或多种可诱导元件，其位于所述启动子和开放阅读框之间。
15.根据权利要求14所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含两种可诱导元件。
16.根据权利要求14或15所述的多顺反子报告载体，其中所述可诱导元件是Tet操纵子2(TetO2)可诱导元件。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述启动子是组成型启动子。
18.根据权利要求17所述的多顺反子报告载体，其中所述组成型启动子是巨细胞病毒a(CMV)、胸苷激酶(TK)、eF1-α、泛素C(UbC)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。
19.根据权利要求1-16中任一项所述的多顺反子载体，其中所述启动子是诱导型启动子。
20.根据权利要求19所述的多顺反子载体，其中所述诱导型启动子是四环素响应型启动子。
21.根据权利要求1-16中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述启动子是组织特异性启动子。
22.根据权利要求21所述的多特异性报告载体，其中所述组织特异性启动子对心脏、血液、肌肉、肺、肝、肾、胰腺、脑或皮肤的细胞具有特异性。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的多顺反子报告载体，其还包含位于所述开放阅读框的3'的位点特异性重组酶序列。
24.根据权利要求23所述的多顺反子报告载体，其中所述载体还包含编码可选择标记的核酸，其中当所述位点特异性重组酶序列未重组时，编码所述可选择标记的核酸不与所述启动子可操作地连接，并且当所述位点特异性重组酶序列与其靶位点特异性重组酶序列重组时，编码所述可选择标记的核酸与所述启动子可操作地连接。
25.根据权利要求24所述的多顺反子报告载体，其中所述位点特异性重组酶序列是FRT核酸序列和/或attP核酸和/或loxP核酸序列。
26.根据权利要求24或25所述的多顺反子报告载体，其中所述可选择标记赋予对潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、新霉素或潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素或新霉素的类似物的抗性。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的多顺反子报告载体，其中将编码一种或多种多肽的核酸框内插入所述一个或多个MCS中。
28.根据权利要求27所述的多顺反子报告载体，其中所述一种或多种多肽包含可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、合成致死性、细胞稳态、细胞器稳态或毒性反应的多肽。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的多顺反子报告载体，其还包含一种、两种或三种转录单元，所述转录单元包含位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的启动子和编码转基因的核酸，其中所述报告载体还包含位于所述转录单元的3'且位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的核心绝缘子序列和polyA序列。
30.一种用于接受多顺反子报告载体的受体细胞，其中所述受体细胞包含整合到宿主细胞基因组中的特定位点的重组核酸，其中所述重组核酸包含与编码融合多肽的核酸可操作地连接的第一启动子，其中所述融合多肽包含报告结构域和可选择标记结构域，并且其中所述核酸包含位于编码所述融合多肽的核酸的5'末端的位点特异性重组酶核酸序列。
31.根据权利要求30所述的受体细胞，其中所述启动子是组成型启动子。
32.根据权利要求31所述的受体细胞，其中所述组成型启动子是CMV启动子、TK启动子、eF1-α启动子、UbC启动子、PGK启动子、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。
33.根据权利要求32所述的受体细胞，其中所述启动子是诱导型启动子。
34.根据权利要求33所述的受体细胞，其中所述诱导型启动子是四环素响应型启动子。
35.根据权利要求30-34中任一项所述的受体细胞，其中所述位点特异性重组酶序列是FRT核酸序列和/或attP核酸序列和/或loxP核酸序列。
36.根据权利要求30-35中任一项所述的受体细胞，其中所述融合多肽的报告结构域是荧光报告结构域。
37.根据权利要求30-36中任一项所述的受体细胞，其中所述荧光报告结构域选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP。
38.根据权利要求30-37中任一项所述的受体细胞，其中所述融合多肽的报告结构域是mCherry报告结构域。
39.根据权利要求30-38中任一项所述的受体细胞，其中所述融合多肽的可选择标记结构域赋予对潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素或潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素的类似物的抗性。
40.根据权利要求30-39中任一项所述的受体细胞，其中所整合的重组核酸还包含与启动子可操作地连接的编码四环素阻遏多肽的核酸。
41.根据权利要求40所述的受体细胞，其中所述启动子是人β-肌动蛋白启动子或CAG启动子。
42.根据权利要求30-41中任一项所述的受体细胞，其中将所述重组核酸整合到腺相关病毒S1(AAVS1)基因座、趋化因子(CC基序)受体5(CCR5)基因座、小鼠ROSA26基因座的人直向同源物、hip11(H11)基因座或柠檬酸裂解酶β样基因基因座(CLYBL)中。
43.根据权利要求30-42中任一项所述的受体细胞，其中所述细胞是永生细胞。
44.根据权利要求30-43中任一项所述的受体细胞，其中所述永生细胞是HEK293T细胞、A549细胞、U2OS细胞、RPE细胞、NPC1细胞、MCF7细胞、HepG2细胞、HaCat细胞、TK6细胞、A375细胞或HeLa细胞。
45.根据权利要求30-44中任一项所述的受体细胞，其中所述细胞是多能细胞、诱导多能干细胞或多潜能细胞。
46.根据权利要求30-42中任一项所述的受体细胞，其中所述细胞是原代细胞。
47.一种产生用于接受多顺反子报告载体的受体细胞的方法，所述方法包括将重组核酸引入细胞中，其中所述重组核酸从5'至3'包含
a)用于将同源重组靶向所述细胞中的特定位点的第一核酸，
b)第一启动子，
c)位点特异性重组酶核酸，
d)编码第一报告多肽和可选择标记的核酸，
e)用于将同源重组靶向所述细胞中的特定位点的第二核酸，
f)第二启动子和编码第二报告多肽的核酸，
其中表达所述第一报告多肽而不表达所述第二报告多肽指示将所述重组核酸的整合靶向所述细胞基因组中的特定位点，并且表达所述第一和第二报告多肽指示随机整合在所述细胞基因组中。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述重组核酸还包含编码四环素阻遏物的核酸，其与用于靶向同源重组的第二核酸的5'的启动子可操作地连接。
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中使用以下将所述重组核酸整合到所述细胞的基因组中：
a)包含核酸酶和指导RNA的RNA指导的重组系统
b)TALEN核酸内切酶，或
c)ZFN核酸内切酶。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的方法，其中选择表达所述第一报告多肽但不表达所述第二报告多肽的细胞。
51.根据权利要求47-50中任一项所述的方法，其中所述位点特异性重组酶核酸是FRT核酸序列和/或attP核酸序列和/或loxP核酸序列。
52.根据权利要求47-51中任一项所述的方法，其中所述第一报告多肽是荧光多肽，并且所述第二报告多肽是不同的荧光多肽。
53.根据权利要求47-52中任一项所述的方法，其中所述第一和第二报告多肽选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP。
54.根据权利要求47-53中任一项所述的方法，其中所述第一报告多肽是mCherry报告物，并且所述第二报告多肽是GFP。
55.根据权利要求47-54中任一项所述的方法，其中所述可选择标记赋予对潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素或潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素的类似物的抗性。
56.根据权利要求47-55中任一项所述的方法，其中所述第一启动子是CMV启动子、TK启动子、eF1-α启动子、UbC启动子、PGK启动子、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子，并且所述第二启动子是CMV启动子、TK启动子、eF1-α启动子、UbC启动子、PGK启动子、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。
57.根据权利要求47-56中任一项所述的方法，其中用于靶向同源重组的所述第一核酸和用于靶向同源重组的所述第二核酸将重组靶向AAVS1基因座、CCR5基因座、小鼠ROSA26基因座的人直向同源物、H11基因座或CLYBL基因座。
58.根据权利要求47-57中任一项所述的方法，其中所述细胞是永生细胞。
59.根据权利要求47-58中任一项所述的方法，其中所述永生细胞是HEK293T细胞、A549细胞、U2OS细胞、RPE细胞、NPC1细胞、MCF7细胞、HepG2细胞、HaCat细胞、TK6细胞、A375细胞或HeLa细胞。
60.根据权利要求47-59中任一项所述的方法，其中所述细胞是多能细胞、诱导多能干细胞或多潜能细胞。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述诱导多能干细胞是WTC-11细胞或NCRM5细胞。
62.根据权利要求47-58中任一项所述的方法，其中所述细胞是原代细胞。
63.一种受体细胞系，其用根据权利要求47-62中任一项所述的方法产生。
64.一种多报告细胞，其包含根据权利要求30-46中任一项所述的受体细胞，其中...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·S·G·德·阿布鲁·里贝罗，C·I·拉卡约，M·J·C·卢德兰，
申请(专利权)人：凯恩生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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