用于选择性转导靶细胞的基于衔接子的逆转录病毒载体系统技术方案

本发明专利技术提供了一种组合物，该组合物包含：i)假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其包含a)具有抗原结合活性的一种包膜蛋白，其中所述包膜蛋白是不与至少一个其天然受体相互作用的重组蛋白，并在其胞外域与包含对标记的多肽的标签具有特异性的抗原结合结构域的多肽融合，并且其中所述包膜蛋白是源自副粘病毒科的蛋白G、HN或H，和b)源自副粘病毒科的具有融合活性的包膜蛋白；和ii)所述标记的多肽，其中所述标记的多肽与靶细胞表面上表达的抗原特异性结合，从而用所述逆转录病毒载体颗粒转导靶细胞或从而诱导病毒样颗粒摄取到靶细胞中。还公开了其药物组合物和用所述载体颗粒转导靶细胞的体外方法。

Adaptor based retroviral vector system for selective transduction of target cells

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于选择性转导靶细胞的基于衔接子的逆转录病毒载体系统
本专利技术涉及具有对标签的特异性的假型逆转录病毒载体颗粒或其载体样颗粒(VLP)的领域，其中所述标签与结合至靶细胞上表达的抗原的多肽偶联，从而允许用所述逆转录病毒载体颗粒或其载体样颗粒靶向转导多个靶细胞部分。
技术介绍
使用逆转录病毒载体进行基因递送是纠正缺陷基因并为细胞提供新功能的一种广泛使用的方法。然而，由于常用类型的逆转录病毒载体的性质，它们按照设计不是选择性的，这阻碍了逆转录病毒载体在许多治疗领域中的安全性特性和适用性。通常，逆转录病毒载体是用水泡性口炎病毒(VesicularStomatitisVirus，VSV-G)的包膜蛋白假型化的。这种假型转导包括治疗相关细胞类型在内的广泛的靶细胞，但是它可能需要使用刺激剂进行预激活以达到足够的转导效率水平。而且，在混合细胞群体中，需要如磁性细胞分选的选择程序以仅在限定的细胞类型中表达靶基因。因此，避免了导致潜在的副作用的脱靶群体的转导。或者，测试了设计按照设计具有选择性并因此不需要预选择靶群体的LV系统的尝试。但是，这些系统在选择性、生产率或适用性方面受到限制。US20160333374描述了一种基于与VSV-G的胞外域融合的抗体片段如scFV(VSVG-scFV)的系统。目标是将VSV-G的有利生产率与scFV的特异性结合起来。该方法能够实现与靶抗原的结合，但是VSVG-scFV不能介导逆转录病毒与靶细胞膜的融合，并因此也不能介导转导。为了克服这一障碍，必须将未修饰的VSV-G与VSVG-scFV共同展示。因此，功能性但非选择性的VSV-G与选择性但非功能性VSV-G-scFV的共同展示仅导致靶抗原表达细胞的优先转导。但最重要的是，由于(非选择性)天然VSV-G的保留功能，不表达靶抗原的细胞也被转导。因此，该系统有利于靶抗原表达细胞的转导，但不是真正选择性的。较高选择性对于已融合至scFV的用包含具有融合活性的蛋白(F蛋白)和具有抗原结合活性的蛋白(H蛋白)的麻疹病毒包膜蛋白(MV-LV)假型化的重靶向慢病毒载体观察到(WO2008/037458A2)。已经对该系统的广泛应用在体外而且在体内进行了多种抗原的测试(Anliker等(2010))。然而，对于靶向逆转录病毒载体的各自特异性，需要单独的逆转录病毒生产。因此，该系统不允许逆转录病毒载体特异性的完全灵活性。而且，从而对靶向细胞群体的转导效率的控制，例如，通过整合的载体拷贝数(VCN)来控制目的基因的表达率受到限制。不仅成功地用截短的麻疹病毒包膜蛋白对慢病毒载体进行了假型化，而且对γ逆转录病毒载体也进行了成功的假型化(Edes(2016)，Frecha等(2008))。有趣的是，在γ-逆转录病毒载体的情况下，与对于慢病毒载体假型化测试的变体相比，用略有不同的截短变体测量了最高的逆转录病毒载体滴度。尽管这些系统是功能性的，但已观察到一些技术缺陷。例如，逆转录病毒载体滴度高度依赖于生产过程中(即转染HEK-293T细胞时)嵌合H-scFV蛋白的表面表达水平。特别地，已经显示出scFV的框架区的序列影响所展示的scFV的生物物理特性，并因此影响功能性逆转录病毒载体滴度(Friedel等(2015))。Bender等(2016)，Khetawat和Broder(2010)和US9486539B2还显示，源自另一副粘病毒科病毒尼帕(Nipah)病毒的包膜蛋白也可用于假型化慢病毒载体，并任选地将其重新靶向以用于选择性转导。有趣的是，Rasbach等(2013)向MV-LV添加了具有抗原结合功能的非病毒跨膜蛋白，使得使用了3种不同的膜蛋白进行假型化。使用这种方法，麻疹H蛋白的附着功能被非病毒跨膜蛋白替代，但是仍然需要麻疹H蛋白的融合辅助功能来产生功能性假型化慢病毒载体。与仅用2种包膜蛋白假型化的慢病毒载体相比，添加另一膜蛋白使功能性慢病毒载体滴度提高约一个数量级。然而，对于先前已经描述的所有假型化逆转录病毒载体系统，仍然存在一个主要缺点：对于靶向逆转录病毒载体的各自特异性，由于必须使用不同的包膜蛋白构建体，因此需要单独的逆转录病毒产生。假型化逆转录病毒载体的产生不仅费力且昂贵，而且还需要分批进行QC测试以测定功能性逆转录病毒载体滴度。另外，这些系统既不提供高度灵活的解决方案以即时改变假型化逆转录病毒载体的特异性，也不能够控制转导效率以对于特定应用的实际需求而调节。从安全的角度来看，特别是在讨论VCN上限的临床环境中，需要控制整合的载体拷贝数基因组。可选地，在本领域中开发了具有通用逆转录病毒载体的基于通用衔接子的系统，其通过添加对选择的抗原具有特异性的工程化多肽而变得具有选择性(在Metzner等(2013)中综述)。例如，Roux等(1989)描述了在基于双特异性抗体复合物的γ逆转录病毒载体的情况下的基于衔接子的系统。一种对γ逆转录病毒颗粒特异性的生物素化抗体通过抗生物素蛋白与另一种对靶细胞选择表达的所选择靶抗原特异性的生物素化抗体偶联。但是，作者注意到低转导率，并假设测试的特异性或抗体复合物本身可以解释所观察到的有限效率。Snitkovsky等(2002)提供了基于逆转录病毒载体的替代系统，所述逆转录病毒载体结合由与抗原结合配体如scFV融合的细胞外受体结构域组成的重组衔接子分子。在这里，再次观察到具有最高5％的转导靶细胞的非常有限的效率。Morizono等(2009)开发了慢病毒载体，其提供了特异性结合用作衔接子分子的抗体Fc部分的蛋白A结构域。由于Fc对蛋白A的亲和力低，因此还评估了生物素抗生物素蛋白的相互作用。生物素通过插入的细菌生物素衔接子肽(BAP)将加入病毒包膜蛋白中。在此，使用抗生物素蛋白缀合的IgG作为衔接子。然而，抗生物素蛋白也结合带电的细胞表面分子。因此，作为结果，抗生物素蛋白缀合的抗体也可以非特异性地与非靶细胞结合，这限制了其适用性。Kaikkonen等(2009年)也使用生物素抗生物素蛋白相互作用来特异地转导具有衔接子分子的靶细胞。这次，展示抗生物素蛋白的逆转录病毒载体应用于生物素化的配体或抗体。将抗生物素蛋白添加到VSV-G的跨膜锚中以有效并入(抗生物素蛋白-VSVG)。由于该重组包膜蛋白仅促进结合但不再促进融合，所以源自杆状病毒的gp64在逆转录病毒载体的表面上共表达。Kaikkonen等(2009)选择了对在肿瘤细胞上过表达的受体(转铁蛋白受体，EGFR和CD46)特异性的衔接子。该系统并非真正选择性的，因为gp64与抗生物素蛋白-VSVG一起在逆转录病毒载体包膜上共同展示。衔接子的添加增强了靶细胞群体的转导，但是还检测到非特异性转导。对于使用生物素相互作用的所有适应性逆转录病毒载体系统，非特异性转导尤其关键。生物素特异性逆转录病毒载体可与细胞表面上存在的天然存在的生物素结合，其诱导这些细胞的非特异性转导。反之亦然，对生物素特异性的衔接子分子也可以与非靶细胞上存在的天然存在的生物素结合。Hoop(2014)使用以麻疹病毒包膜蛋白(MV-LV)假型化的慢病毒载体来开发基于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，包含/ni)假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其包含：/na)一种具有抗原结合活性的包膜蛋白，其中所述包膜蛋白是不与至少一个其天然受体相互作用的重组蛋白，并且在其胞外域处与包含对标记的多肽的标签特异性的抗原结合结构域的多肽融合，并且其中所述包膜蛋白源自副粘病毒科的蛋白G、HN或H，/nb)一种源自副粘病毒科的具有融合活性的包膜蛋白，和/nii)所述标记的多肽，其中所述标记的多肽与靶细胞表面表达的抗原特异性结合，从而用所述逆转录病毒载体颗粒转导所述靶细胞或从而诱导所述病毒样颗粒摄取至所述靶细胞中。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171030 EP 17199170.61.一种组合物，包含
i)假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其包含：
a)一种具有抗原结合活性的包膜蛋白，其中所述包膜蛋白是不与至少一个其天然受体相互作用的重组蛋白，并且在其胞外域处与包含对标记的多肽的标签特异性的抗原结合结构域的多肽融合，并且其中所述包膜蛋白源自副粘病毒科的蛋白G、HN或H，
b)一种源自副粘病毒科的具有融合活性的包膜蛋白，和
ii)所述标记的多肽，其中所述标记的多肽与靶细胞表面表达的抗原特异性结合，从而用所述逆转录病毒载体颗粒转导所述靶细胞或从而诱导所述病毒样颗粒摄取至所述靶细胞中。


2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述具有抗原结合活性的包膜蛋白不是人嗜性的。


3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中在存在所述标记的多肽的情况下，所述靶细胞上的所述转导或所述诱导的摄取比在非靶细胞上高至少10倍。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述副粘病毒科病毒是麻疹病毒属或亨尼巴病毒属的病毒。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述源自副粘病毒科病毒的蛋白G或H的蛋白质缺少所述蛋白G或H的胞质区的至少一部分。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述源自副粘病毒科的具有融合活性的包膜蛋白缺少所述包膜蛋白的胞质区的至少一部分。


7.根据权利要求2至6中任一项所述的组合物，其中所述麻疹病毒属是麻疹病毒或麻疹病毒的Edmonston株。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述逆转录病毒载体颗粒是慢病毒或γ逆转录病毒载体颗粒或其病毒颗粒。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述标记的多肽的多肽是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·斯卡赛尔，N·科德斯，J·米泰尔斯塔特，A·凯泽，
申请(专利权)人：美天施生物科技有限两合公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE