乳腺癌21基因检测试剂盒及其应用方法技术

本发明专利技术属于生物技术及医学领域，具体涉及乳腺癌21基因检测试剂盒，包括分别检测Ki67、STK15、Survivin、CCNB1、MYBL2、MMP11、CTSL2、GRB7、HER2、ER、PGR、BCL2、SCUBE2、GSTM1、BAG1、CD68、β‑actin、GAPDH、RPLP0、GUS和TFRC基因的特异性引物和探针、阳性质控品和用于荧光定量PCR检测常见测组件等。本发明专利技术还提供了上述试剂盒的使用方法。本发明专利技术的试剂盒通过检测与人类乳腺癌相关的21种基因，来评估乳腺癌患者的复发风险与化疗获益程度，具有灵敏度高，特异性强，检测操作简单等特点。

Breast cancer 21 gene detection kit and its application

【技术实现步骤摘要】
乳腺癌21基因检测试剂盒及其应用方法
本专利技术属于生物技术及医学领域，具体涉及乳腺癌21基因检测试剂盒及其应用方法。
技术介绍
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来以手术为主，放射治疗、化疗、内分泌治疗为辅助的多学科综合治疗模式使乳腺癌的复发和病死率显著降低。随着基因组学的发展，学者们发现检测一些多基因标志物，可能比临床病例指标更能准确的预测肿瘤的复发。从而判断患者是否从化疗中获益，避免过度治疗。最早由Paik等提出的21基因检测是已被临床证实的用于评估ER阳性、腋窝淋巴结阴性早期乳腺癌患者复发风险的检测方法。这21个基因包括16个肿瘤相关基因及5个参考基因，其中肿瘤增值相关基因(Ki67、STK15、Survivin、CCNB1和MYBL2)、表皮生长因子受体HER2相关基因(GRB7和HER2)、激素(Estrogen)相关基因(ER、PGR、BCL2和SCUBE2)、浸润(Invasion)相关基因(MMP11和CTSL2)和3个未分类基因(GSTM1、CD68和BAG1)。5个参考基因分别为(β-actin、GAPDH、RPLPO、GUS和TFRC)。激素相关基因、GSTM1、BAG1的高表达将导致一个较低的复发分数(recurrencescore,RS)，而增值相关基因、HER-2相关基因、侵袭相关基因和CD68的高表达将导致一个较高的RS值。NSABPB-14和B-20的实验结果表明，RS﹤18时为低复发风险；18≤RS＜31时为中复发风险；RS≥31时为高复发风险。近年来，大规模临床研究证实，复发分数与局部复发及病死率密切相关。目前21基因的检测主要是通过从病人的石蜡标本中提取mRNA，然后进行RT-QPCR的方法来检测各个基因的表达再量化为复发风险评分(RS)。在基因检测实验的过程中，一个realtimePCR反应体系中引物的用量极少不到1μl。而PCR反应本身就是灵敏度极高的实验，如此多的基因配成反应孔在检测实验操作时极易产生误差，且操作过程繁琐耗时多。如何能得到相应基因的精确CT值及能减少实验时间和减小实验误差成了亟待解决的问题。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术提供了乳腺癌21基因检测试剂盒及其使用方法，目的是为了解决现有技术中基因配成反应孔在检测实验操作时极易产生误差，且操作过程繁琐耗时多的技术问题。本专利技术提供的乳腺癌21基因检测试剂盒，具体技术方案如下：乳腺癌21基因检测试剂盒，包括21个检测基因，所述21个检测基因如下：Ki67、STK15、Survivin、CCNB1、MYBL2、MMP11、CTSL2、GRB7、HER2、ER、PGR、BCL2、SCUBE2、GSTM1、BAG1、CD68、β-actin、GAPDH、RPLPO、GUS和TFRC；所述21个检测基因各设计了1对引物和1条特异性探针，21个检测基因所对应的引物序列和Taqman探针序列分别如下：(1)检测Ki67基因的引物序列为：SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，检测Ki67基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：3；具体如下：Ki67：F)P1-KI675’-CTCCATGTGCCTGAGAT-3’(SEQIDNO：1)R)P1-KI675’-TTCTGCACACCTCTTGACAC-3’(SEQIDNO：2)ProbeP1-KI675’FAM-AAAGACAAAAAGCCAGCCTGCAGC-3’BHQ1(SEQIDNO：3)(2)检测STK15基因的引物序列为SEQIDNO：4和SEQIDNO：5，检测STK15基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：6；具体如下：STK15：F)P2-STK155’-ATCTCTGGAGCCTTGGAGTT-3’(SEQIDNO：4)R)P2-STK155’-CTGGCTGGGATTATGCTTCA-3’(SEQIDNO：5)ProbeP2-STK155’FAM-TTGTAACAGAGGGAGCCAGGGACC-3’BHQ1(SEQIDNO：6)(3)检测Survivin基因的引物序列为SEQIDNO：7和SEQIDNO：8，检测Survivin基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：9；具体如下：Survivin：F)P3-Survivin5’-CCACCGCATCTCTACATTCA-3’(SEQIDNO：7)R)P3-Survivin5’-AGAAGAAACACTGGGCCAAG-3’(SEQIDNO：8)ProbeP3-Survivin5’FAM-TTCATCCACTGCCCCACTGAGAA-3’BHQ1(SEQIDNO：9)(4)检测CCNB1基因的引物序列为SEQIDNO：10和SEQIDNO：11，检测CCNB1基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：12；具体如下：CCNB1：F)P4-CCNB15’-TAAACTTTGGTCTGGGTCGG-3’(SEQIDNO：10)R)P4-CCNB15’-GAGAAGGAGGAAAGTGCACC-3’(SEQIDNO：11)ProbeP4-CCNB15’FAM-ACCTTTGCACTTCCTTCGGAGAGC-3’BHQ1(SEQIDNO：12)(5)检测MYBL2基因的引物序列为SEQIDNO：13和SEQIDNO：14，检测MYBL2基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：15；具体如下：MYBL2：F)P5-MYBL25’-AAGAACGCCCTGGAGAAGTA-3’(SEQIDNO：13)R)P5-MYBL25’-GACTTTCTTGATGGGGCTCC-3’(SEQIDNO：14)ProbeP5-MYBL25’FAM-CCCGAGAAGCAGAAGAGGAAGCCT-3’BHQ1(SEQIDNO：15)(6)检测MMP11基因的引物序列为SEQIDNO：16和SEQIDNO：17，检测MMP11基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：18；具体如下：MMP11：F)P6-MMP115’-GGGTGTACGACGGTGAAAAG-3’(SEQIDNO：16)R)P6-MMP115’-TCTTGTTCTTCTCGGGACCC-3’(SEQIDNO：17)ProbeP6-MMP115’FAM-CCTGGTGAGGTTCCCGGTCCATG-3’BHQ1(SEQIDNO：18)(7)检测CTSL2基因的引物序列为SEQIDNO：19和SEQIDNO：20，检测CTSL2基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：21；具体如下：CTSL2：F)P7-CTSL5’-GGAGAGCAGTGTGGGAAAAG-3’(SEQIDNO：19)R)P7-CTSL5’-TGTGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.乳腺癌21基因检测试剂盒，其特征在于，包括21个检测基因，所述21个检测基因如下：Ki67、STK15、Survivin、CCNB1、MYBL2、MMP11、CTSL2、GRB7、HER2、ER、PGR、BCL2、SCUBE2、GSTM1、BAG1、CD68、β-actin、GAPDH、RPLPO、GUS和TFRC；/n所述21个检测基因各设计了1对引物和1条特异性探针，21个检测基因所对应的引物序列和Taqman探针序列分别如下：/n(1)检测Ki67基因的引物序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，检测Ki67基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：3；具体如下：/nKi67：/nF)P1-KI67 5’-CTCCATGTGCCTGAGAT-3’(SEQ ID NO：1)/nR)P1-KI67 5’-TTCTGCACACCTCTTGACAC-3’ (SEQ ID NO：2)/nProbe P1-KI67 5’FAM-AAAGACAAAAAGCCAGCCTGCAGC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：3)/n(2)检测STK15基因的引物序列为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，检测STK15基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：6；具体如下：/nSTK15：/nF)P2-STK15 5’-ATCTCTGGAGCCTTGGAGTT-3’ (SEQ ID NO：4)/nR)P2-STK15 5’-CTGGCTGGGATTATGCTTCA-3’ (SEQ ID NO：5)/nProbe P2-STK15 5’FAM-TTGTAACAGAGGGAGCCAGGGACC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：6)/n(3)检测Survivin基因的引物序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，检测Survivin基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：9；具体如下：/nSurvivin：/nF)P3-Survivin 5’-CCACCGCATCTCTACATTCA-3’ (SEQ ID NO：7)/nR)P3-Survivin 5’-AGAAGAAACACTGGGCCAAG-3’ (SEQ ID NO：8)/nProbe P3-Survivin 5’FAM-TTCATCCACTGCCCCACTGAGAA-3’BHQ1 (SEQ ID NO：9)/n(4)检测CCNB1基因的引物序列为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，检测CCNB1基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：12；具体如下：/nCCNB1：/nF)P4-CCNB1 5’-TAAACTTTGGTCTGGGTCGG-3’ (SEQ ID NO：10)/nR)P4-CCNB1 5’-GAGAAGGAGGAAAGTGCACC-3’ (SEQ ID NO：11)/nProbe P4-CCNB1 5’FAM-ACCTTTGCACTTCCTTCGGAGAGC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：12)/n(5)检测MYBL2基因的引物序列为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，检测MYBL2基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：15；具体如下：/nMYBL2：/nF)P5-MYBL2 5’-AAGAACGCCCTGGAGAAGTA-3’ (SEQ ID NO：13)/nR)P5-MYBL2 5’-GACTTTCTTGATGGGGCTCC-3’ (SEQ ID NO：14)/nProbe P5-MYBL2 5’FAM-CCCGAGAAGCAGAAGAGGAAGCCT-3’BHQ1 (SEQ ID NO：15)/n(6)检测MMP11基因的引物序列为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，检测MMP11基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：18；具体如下：/nMMP11：/nF)P6-MMP11 5’-GGGTGTACGACGGTGAAAAG-3’ (SEQ ID NO：16)/nR)P6-MMP11 5’-TCTTGTTCTTCTCGGGACCC-3’ (SEQ ID NO：17)/nProbe P6-MMP11 5’FAM-CCTGGTGAGGTTCCCGGTCCATG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：18)/n(7)检测CTSL2基因的引物序列为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，检测CTSL2基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：21；具体如下：/nCTSL2：/nF)P7-CTSL 5’-GGAGAGCAGTGTGGGAAAAG-3’ (SEQ ID NO：19)/nR)P7-CTSL 5’-TGT...

【技术特征摘要】
1.乳腺癌21基因检测试剂盒，其特征在于，包括21个检测基因，所述21个检测基因如下：Ki67、STK15、Survivin、CCNB1、MYBL2、MMP11、CTSL2、GRB7、HER2、ER、PGR、BCL2、SCUBE2、GSTM1、BAG1、CD68、β-actin、GAPDH、RPLPO、GUS和TFRC；
所述21个检测基因各设计了1对引物和1条特异性探针，21个检测基因所对应的引物序列和Taqman探针序列分别如下：
(1)检测Ki67基因的引物序列为：SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，检测Ki67基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：3；具体如下：
Ki67：
F)P1-KI675’-CTCCATGTGCCTGAGAT-3’(SEQIDNO：1)
R)P1-KI675’-TTCTGCACACCTCTTGACAC-3’(SEQIDNO：2)
ProbeP1-KI675’FAM-AAAGACAAAAAGCCAGCCTGCAGC-3’BHQ1(SEQIDNO：3)
(2)检测STK15基因的引物序列为SEQIDNO：4和SEQIDNO：5，检测STK15基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：6；具体如下：
STK15：
F)P2-STK155’-ATCTCTGGAGCCTTGGAGTT-3’(SEQIDNO：4)
R)P2-STK155’-CTGGCTGGGATTATGCTTCA-3’(SEQIDNO：5)
ProbeP2-STK155’FAM-TTGTAACAGAGGGAGCCAGGGACC-3’BHQ1(SEQIDNO：6)
(3)检测Survivin基因的引物序列为SEQIDNO：7和SEQIDNO：8，检测Survivin基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：9；具体如下：
Survivin：
F)P3-Survivin5’-CCACCGCATCTCTACATTCA-3’(SEQIDNO：7)
R)P3-Survivin5’-AGAAGAAACACTGGGCCAAG-3’(SEQIDNO：8)
ProbeP3-Survivin5’FAM-TTCATCCACTGCCCCACTGAGAA-3’BHQ1(SEQIDNO：9)
(4)检测CCNB1基因的引物序列为SEQIDNO：10和SEQIDNO：11，检测CCNB1基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：12；具体如下：
CCNB1：
F)P4-CCNB15’-TAAACTTTGGTCTGGGTCGG-3’(SEQIDNO：10)
R)P4-CCNB15’-GAGAAGGAGGAAAGTGCACC-3’(SEQIDNO：11)
ProbeP4-CCNB15’FAM-ACCTTTGCACTTCCTTCGGAGAGC-3’BHQ1(SEQIDNO：12)
(5)检测MYBL2基因的引物序列为SEQIDNO：13和SEQIDNO：14，检测MYBL2基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：15；具体如下：
MYBL2：
F)P5-MYBL25’-AAGAACGCCCTGGAGAAGTA-3’(SEQIDNO：13)
R)P5-MYBL25’-GACTTTCTTGATGGGGCTCC-3’(SEQIDNO：14)
ProbeP5-MYBL25’FAM-CCCGAGAAGCAGAAGAGGAAGCCT-3’BHQ1(SEQIDNO：15)
(6)检测MMP11基因的引物序列为SEQIDNO：16和SEQIDNO：17，检测MMP11基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：18；具体如下：
MMP11：
F)P6-MMP115’-GGGTGTACGACGGTGAAAAG-3’(SEQIDNO：16)
R)P6-MMP115’-TCTTGTTCTTCTCGGGACCC-3’(SEQIDNO：17)
ProbeP6-MMP115’FAM-CCTGGTGAGGTTCCCGGTCCATG-3’BHQ1(SEQIDNO：18)
(7)检测CTSL2基因的引物序列为SEQIDNO：19和SEQIDNO：20，检测CTSL2基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：21；具体如下：
CTSL2：
F)P7-CTSL5’-GGAGAGCAGTGTGGGAAAAG-3’(SEQIDNO：19)
R)P7-CTSL5’-TGTGAAGCCATGTTTCCCTT-3’(SEQIDNO：20)
ProbeP7-CTSL5’FAM-TGAACTGCACAATGGGGAATACAGCC-3’BHQ1(SEQIDNO：21)
(8)检测GRB7基因的引物序列为SEQIDNO：22和SEQIDNO：23，检测GRB7基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：24；具体如下：
GRB7：
F)P8-GRB75’-CTTCGGTTTCTGTGTCAAGC-3’(SEQIDNO：22)
R)P8-GRB75’-GGCTCTGCTCATCTTCACTG-3’(SEQIDNO：23)
ProbeP8-GRB75’FAM-AAGCTTCGAAATGGCCACAAGGGG-3’BHQ1(SEQIDNO：24)
(9)检测HER2基因的引物序列为SEQIDNO：25和SEQIDNO：26，检测HER2基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：27；具体如下：
HER2：
F)P9-HER25’-AGAACCCCGAGTACTTGACA-3’(SEQIDNO：25)
R)P9-HER25’-ATAGAGGTTGTCGAAGGCTG-3’(SEQIDNO：26)
ProbeP9-HER25’FAM-CCCACCCTCCTCCTGCCTTCAG-3’BHQ1(SEQIDNO：27)
(10)检测ER基因的引物序列为SEQIDNO：28和SEQIDNO：29，检测ER基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：30；具体如下：
ER：
F)P10-ER5’-TCATCCTCTCCCACATCAGG-3’(SEQIDNO：28)
R)P10-ER5’-ATCTCCAGCAGCAGGTCATA-3’(SEQIDNO：29)
ProbeP10-ER5’FAM-ATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCC-3’BHQ1(SEQIDNO：30)
(11)检测PGR基因的引物序列为SEQIDNO：31和SEQIDNO：32，检测PGR基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：33；具体如下：
PGR：
F)P11-PGR5’-GCTCACAGCGTTTCTATCAAC-3’(SEQIDNO：31)
R)P11-PGR5’-TCACCATCCCTGCCAATATC-3’(SEQIDNO：32)
ProbeP11-PGR5’FAM-TTATCCAGTCCCGGGCACTGAGTG-3’BHQ1(SEQIDNO：33)
(12)检测BCL2基因的引物序列为SEQIDNO：34和SEQIDNO：35，检测BCL2基因的Taqman探针序列为：SEQIDNO：36；具体如下：
BCL2：
F)P12-BCL25’-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3’(SEQIDNO：34)
R)P12-BCL25’-TACTCAGTCATCCACAGGGC-3’(SEQIDNO：35)
ProbeP12-BCL25’FAM-CATGTGTGTGGAGAGCGTCAACCG-3’BHQ1(SEQIDNO：36)
(13)检测SCUBE2基因的引物序列为SEQIDNO：37和SEQIDNO：38，检测SCUBE2基因的Taqman探针序列为：SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：田晓丽，
申请(专利权)人：宁波美丽人生医药生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33