一种与肝癌诊断相关的血清外泌体miRNA标志物及其应用制造技术

技术编号:24325469 阅读:56 留言:0更新日期:2020-05-29 17:57
本发明专利技术属于生物诊断和医药领域,特别涉及一种与肝癌诊断相关的血清外泌体miRNA标志物及其应用,该标志物为has‑miRNA‑21‑5p,将has‑miRNA‑21‑5p作为肝癌的生物标记物,通过检测其表达量诊断检测者是否患有肝癌或具有患肝癌风险,具有检测方便、伤害小等特点,同时定量准确,可以提高检测的灵敏性和特异性,has‑miRNA‑21‑5p及其特异性扩增引物可用于制备肝癌诊断试剂盒,方便在早期进行快速、辅助诊断,为临床医生进一步深入检查或快速准确掌握患者的疾病状态提供依据。

A serum exosome miRNA marker related to the diagnosis of liver cancer and its application

【技术实现步骤摘要】
一种与肝癌诊断相关的血清外泌体miRNA标志物及其应用
本专利技术属于生物医药领域,具体涉及一种与肝癌诊断相关的血清外泌体miRNA标志物及其应用。
技术介绍
肝细胞性肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是全球范围内发病率第六的恶性肿瘤,居癌症相关死亡原因的第三位。目前,外科手术切除仍然是治疗HCC最有效的治疗手段,但HCC的高转移率及高复发率严重制约了HCC患者的远期疗效。同时,临床上常用的HCC特异性诊断指标不够敏感,又因肝脏具有强大的代偿能力,当患者出现症状就诊时多已处于癌症中、晚期,能够获得根治性手术者不足10%。因此,阐释HCC发生发展的具体机制、探究临床治疗靶点及寻找可靠的HCC切除预后指标是目前急需解决的问题。肿瘤的生长,尽管主体是肿瘤细胞本身的无限制增殖,但肿瘤细胞与邻近细胞之间的交互作用越来越受到关注。近年来,肿瘤细胞释放的外泌体在肿瘤生长过程中的重要作用逐渐被认知,外泌体在运送生物活性物质至受体细胞的过程中,囊泡内物质免于被细胞间隙的酶类水解,保证了生物学活性物质传输的有效性。因此,外泌体在阐释肿瘤发生发展、转移及治疗选择方面提供了良好的靶点,其在肿瘤发展过程中发挥至关重要的作用。外泌体囊泡发挥作用主要依靠外泌体的生物活性物质,包括蛋白、mRNA、非编码RNA、DNA片段等,其中,miRNAs作为外泌体内非编码RNA中表达量最高的核酸物质,其表达异常促进了肿瘤的发生发展。研究表明,miRNA能够调控人类三分之一基因的表达,一个miRNA也能够同时调控几百个基因的表达。因此,单个miRNAs的异常表达也有可能使正常细胞转化成肿瘤细胞。目前越来越多的证据表明,失衡的外泌体miRNAs是肿瘤细胞与受体细胞的重要联系。因此,亟需开发一种外泌体miRNAs为HCC临床诊断、治疗及预后判断提供新的理论依据。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足,提供一种与肝癌诊断相关的血清外泌体miRNA标志物及其应用。为实现上述技术目的,本专利技术采取的技术方案为:本专利技术提供了一种与肝癌诊断相关的血清外泌体miRNA标志物,所述标志物为has-miRNA-21-5p。本专利技术还提供了上述has-miRNA-21-5p在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。本专利技术还提供了标志物has-miRNA-21-5p的特异性扩增引物,所述特异性扩增引物为:正向引物has-miRNA-21-5p-F和反向引物has-miRNA-21-5p-R,所述正向引物has-miRNA-21-5p-F的核苷酸序列为SEQIDNO.17,所述反向引物has-miRNA-21-5p-R的核苷酸序列为SEQIDNO.18。本专利技术还提供了上述特异性扩增引物has-miRNA-21-5p-F/has-miRNA-21-5p-R在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。本专利技术还提供了一种肝癌诊断试剂盒,所述试剂盒用于检测血清外泌体miRNA中has-miRNA-21-5p的表达量。进一步地,所述试剂盒包含标志物has-miRNA-21-5p的特异性扩增引物has-miRNA-21-5p-F和has-miRNA-21-5p-R。进一步地,所述试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。本专利技术还提供了has-miRNA-21-5p模拟物在制备肝癌动物模型中的应用,所述has-miRNA-21-5p模拟物的核苷酸序列为SEQIDNO.1。本专利技术还提供了has-miRNA-21-5p抑制物在制备治疗肝癌产品中的应用,所述has-miRNA-21-5p抑制物的上游序列为SEQIDNO.2,所述has-miRNA-21-5p抑制物的下游序列为SEQIDNO.3。与现有技术相比,本专利技术的有益效果在于:1)本专利技术首次发现血清外泌体中的has-miRNA-21-5p可作为肝癌诊断的生物标记物,具有检测方便、伤害小的特点,并且定量准确,可以提高HCC诊断的灵敏性和特异性;2)has-miRNA-21-5p外泌体取自血清,可避免侵入性诊断,易于提取,需要血清量少,减少检测者血液抽取量;3)本专利技术还制备肝癌诊断试剂盒,该试剂盒包含特异性扩增引物has-miRNA-21-5p-F和has-miRNA-21-5p-R及qRT-PCR技术常用的其他试剂,通过检测检测者血清中外泌体has-miRNA-21-5p的表达量,即可在早期进行快速、辅助诊断,为临床医生进一步深入检查或快速准确掌握患者的疾病状态提供依据,帮助医生及时采取防治方案,延缓和阻止疾病进展;4)has-miRNA-21-5p抑制物通过抑制外泌体中的has-miRNA-21-5p表达能够抑制移植瘤的生长,为制备肝癌治疗产品奠定了基础。附图说明图1为本专利技术实施例1中不同来源外泌体鉴定结果,其中,a为不同细胞来源外泌体的透射电子显微镜成像图,b为随机不同视野下各细胞来源外泌体直径,c为随机不同视野下各细胞来源外泌体数量,d为WesternBlot法鉴定外泌体标记物CD63、CD81、CD9表达水平(***p<0.001)。图2为本专利技术实施例1中CCK-8实验检测has-miRNA-21-5p刺激后的细胞增殖水平,其中,a为CCK-8实验检测不同时间点下has-miRNA-21-5p对HSCs细胞增殖水平的影响;b为CCK-8实验检测has-miRNA-21-5p对HSCs增殖水平的影响(**p<0.01,***p<0.001)。图3为本专利技术实施例2的肝癌细胞迁移效果图。图4为本专利技术实施例3的皮下移植瘤生长状态图(**p<0.01,***p<0.001)。图5为本专利技术实施例4的不同细胞来源外泌体刺激后的HSCs合成促血管生成因子的能力检测结果(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。图6为本专利技术实施例5的肝癌组和对照组提取的血清外泌体鉴定结果,其中a为肝癌组(HCC)和对照组(Normal)的外泌体的透射电子显微镜成像图,b为随机不同视野下肝癌组(HCC)和对照组(Normal)的血清外泌体直径,c为随机不同视野下肝癌组(HCC)和对照组(Normal)的血清外泌体数量,d为WesternBlot法鉴定肝癌组(HCC)和对照组(Normal)的血清外泌体标记物CD63、CD81、CD9表达水平(***p<0.001)。图7为本专利技术实施例5的肝癌组和对照组血清外泌体中has-miRNA-21-5p的相对表达量结果(**p<0.01)。具体实施方式为了使本领域
人员更好地理解本专利技术的技术方案,下面通过具体实施例对本专利技术作进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,所用的试剂、方法和设备,如无特殊说明,均为本
常规试剂、方法和设备。以下实施例中的定量实验,均设置三次重复实验,取平均值;使用t检验方法统本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种与肝癌诊断相关的血清外泌体miRNA标志物,其特征在于,所述标志物为has-miRNA-21-5p。/n

【技术特征摘要】
1.一种与肝癌诊断相关的血清外泌体miRNA标志物,其特征在于,所述标志物为has-miRNA-21-5p。


2.权利要求1所述的miRNA标志物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。


3.权利要求1所述的miRNA标志物的特异性扩增引物,其特征在于,所述特异性扩增引物为:正向引物has-miRNA-21-5p-F和反向引物has-miRNA-21-5p-R,所述正向引物has-miRNA-21-5p-F的核苷酸序列为SEQIDNO.17,所述反向引物has-miRNA-21-5p-R的核苷酸序列为SEQIDNO.18。


4.权利要求3所述的miRNA标志物的特异性扩增引物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。


5.一种肝癌诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒用于检测血清外泌体miRNA中has-m...

【专利技术属性】
技术研发人员:施晓雷任昊桢王经琳丁义涛
申请(专利权)人:南京鼓楼医院
类型:发明
国别省市:江苏;32

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