本发明专利技术了公开了一种检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒，涉及核酸检测技术领域。该试剂盒包括：用于检测L858R位点突变的引物对、突变型荧光探针、野生型荧光探针、阳性质控品、阴性质控品和反应预混液。该试剂盒针对EGFR基因L858R位点设计了特定序列的引物和锁核酸探针，并优化了其反应体系，利用数字PCR平台实现了对EGFR基因L858R位点突变的高灵敏度检测，对低浓度DNA样本能够有效分辨低至1:3000的突变，操作简单，结果稳定，准确度高，数据扩增效果好，可广泛应用于非小细胞肺癌EGFR突变型的早筛和治疗过程中的耐药监测。
【技术实现步骤摘要】
一种检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒
本专利技术涉及核酸检测
，具体涉及一种检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒。
技术介绍
近年来，每年的新发癌症病例高达429万，其中肺癌位居发病率与死亡率第一位，分别占恶性肿瘤新发病例的13％和18％，尽管肺癌的诊断方法和治疗手段不断提高，但肺癌的死亡率仍未得到有效控制。在全部肺癌中，非小细胞肺癌(Non-SmallCellLungCancer,NSCLC)占80％以上，中国人群非小细胞肺癌患者最常见的致病突变来自表皮生长因子受体基因(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)。表皮生长因子受体(EGFR)是一种跨膜蛋白，广泛分布于人体各组织细胞膜上，是跨膜受体酪氨酸家族中的成员之一。由细胞外的配体结合区、疏水跨膜结构域和细胞内的激酶区三部分组成。EGFR基因可调控细胞的凋亡、增殖、分化、迁移和细胞周期循环，加快肿瘤细胞的增殖，促进新生血管生成，加速肿瘤转移并抑制肿瘤细胞凋亡。EGFR基因突变主要发生在第19-21号外显子上，包括第19号外显子的缺失突变(19del)，第20号外显子的点突变(T790M)和片段插入，以及第21号外显子的点突变(如：L858R、L861Q等)。在肿瘤的治疗中，酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitor,TKI)通过与EGFR胞外配体结合部位的竞争，阻断EGFR信号通路，从而起到抗肿瘤的作用。然而，相当一部分患者会出现耐药性，这种获得性耐药主要由基因的二次突变引起的，常见的突变包括：T790M和L858R等。近年来，以血液等为样本基础的液体活检技术飞速发展。当肿瘤组织难以获取时，无创、易采集的血液检测是组织EGFR基因突变分析合适的替代选择，并且血液检测在一定程度上能有效克服肿瘤异质性，可实现无创实时动态检测等，广泛应用于肺癌早筛和治疗中耐药性监测。由于血液中游离DNA含量极低，长度约70-200bp，其中突变相关游离DNA(cellfreeDNA,cfDNA)含量更少，约占总游离DNA含量的1％，普通试剂盒精密度和灵敏度无法达到检测要求。目前，用于检测外周血EGFR突变的方法有很多，包括测序法、实时荧光定量PCR(real-timePCR,RT-PCR)、变性高效液相色谱法(denaturinghighperformance1iquidchromatography,DHPLC)及数字PCR(dPCR)等。测序法是目前检测基因突变最基础、应用最广泛的一种方法，但需要对待测序样品进行扩增、纯化、序列分析，过程繁琐，耗时较长，灵敏度较低，因此在临床应用中存在一定的限制，不适用于大量临床样品分析。用RT-PCR检测目的基因，虽然可检测出微小突变，但该技术的定量检测依赖于Ct值，而Ct值会受扩增效率的影响，这在一定程度上限制了精确定量检测，得到的是相对含量，无法实现绝对定量。DHPLC技术的检测灵敏度同样较低，且不能检测出突变的具体类型，结果判读容易出错，当有多个片段需要检测时，由于有多个解链温度，需要多步检测，增加了工作量。数字PCR技术无需采用内参基因和标准曲线，准确度高、重现性好，可以实现绝对定量分析，为有效提高基因突变检测灵敏度以及精准度提供了可能。该技术是将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元里。根据每个反应单元中扩增后的荧光信号相对比例和反应单元的体积，通过泊松分布计算出核酸靶分子的浓度。数字PCR技术极大地提高了检测灵敏度和检出率。但目前使用的数字PCR仪器操作步骤多且复杂，滴定式数字PCR由于液滴有相对损耗，对于超低含量的目的物检测不准，需要额外的质控体系；芯片式数字PCR也同样需要多种仪器组合，价格昂贵且操作不便利，无法满足临床便捷使用的需求。基于数字PCR系统提供相应的检测试剂，成为现今检测基因突变的必然趋势。中国专利CN108998526A公开了一种检测EGFR基因21外显子基因突变的试剂盒及方法，该试剂盒基于dPCR平台能检出0.1％的突变率。中国专利CN108841953A公开了一种利用数字PCR技术检测EGFR基因22种突变的试剂盒，该试剂盒可检测出2ng/μL的DNA样本。现有的基于数字PCR检测EGFR基因突变的试剂种类较少，仍存在一些不足之处，包括难以有效检测出DNA含量极低的样本，且灵敏度低等。因此，本专利技术开发了一种基于数字PCR检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒。对肿瘤、血液、唾液、血清中EGFR基因的L858R突变进行快速检测，提供绝对定量。操作更加便捷，能够对极低检测目的物进行准确的定性、定量检测，灵敏度更高，数据结果稳定可靠，能够更便捷地用于辅助诊断与临床治疗指导。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒。克服了现有技术中存在的问题，能够对极低检测目的物进行准确的定性、定量检测，提高了灵敏度。本专利技术一方面提供了一种检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒，所述的试剂盒包括引物对A和荧光探针B；所述的引物对A包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列为：5’-CACCGCAGCATGTCAAGATCA-3’；如SEQIDNO:1所示；所述下游引物的核苷酸序列为：5’-CTTTGCCTCCTTCTGCATGGTAT-3’；如SEQIDNO:2所示；所述的荧光探针B包括突变型荧光探针和野生型荧光探针；所述突变型荧光探针的核苷酸序列为：5’-TTGGGCGGGCCAAAC-3’；如SEQIDNO:3所示；所述野生型荧光探针的核苷酸序列为：5’-TTGGGCTGGCCAAAC-3’；如SEQIDNO:4所示；进一步地，所述突变型荧光探针和野生型荧光探针的5’端第7位碱基均是经锁核酸修饰的碱基。进一步地，所述的锁核酸结构如式(1)所示：优选地，所述的荧光探针B的5’端含有荧光报告基团FAM和/或CY3，3’端含有荧光淬灭基团BHQ-1和/或BHQ-2；进一步优选地，所述的突变型荧光探针的5’端含有荧光报告基团FAM，所述的突变型荧光探针的3’端含有荧光淬灭基团BHQ-1；所述的野生型荧光探针的5’端含有荧光报告基团CY3，所述的野生型荧光探针的3’端含有荧光淬灭基团BHQ-2。优选地，所述的试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品；所述的阳性质控品含有1％L858R突变的DNA，所述的阴性质控品含有EGFR基因野生型的DNA。优选地，所述的试剂盒还包括反应预混液，所述的反应预混液包括但不限于以下试剂：dATP、dCTP、dGTP、dTTP、镁离子、BSA(牛血清白蛋白)、热启动Taq酶和单分子扩增增强剂等；所述的单分子扩增增强剂包括甜菜碱2M、体积比为0.2％的TritonX-100、和热稳定焦磷酸酶0.1U。进一步优选地，所述的反应预混液包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP浓度均为0.4mM，BSA浓度为10μg/μL，热启动Taq酶浓度本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括引物对A和荧光探针B；/n所述的引物对A包括上游引物和下游引物；/n所述上游引物的核苷酸序列为：5’-CACCGCAGCATGTCAAGATCA-3’；/n所述下游引物的核苷酸序列为：5’-CTTTGCCTCCTTCTGCATGGTAT-3’；/n所述的荧光探针B包括突变型荧光探针和野生型荧光探针；/n所述突变型荧光探针的核苷酸序列为：5’-TTGGGCGGGCCAAAC-3’；/n所述野生型荧光探针的核苷酸序列为：5’-TTGGGCTGGCCAAAC-3’；/n所述突变型荧光探针和野生型荧光探针的5’端第7位碱基均是经锁核酸修饰的碱基。/n
【技术特征摘要】
1.一种检测EGFR基因L858R位点突变的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括引物对A和荧光探针B；
所述的引物对A包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的核苷酸序列为：5’-CACCGCAGCATGTCAAGATCA-3’；
所述下游引物的核苷酸序列为：5’-CTTTGCCTCCTTCTGCATGGTAT-3’；
所述的荧光探针B包括突变型荧光探针和野生型荧光探针；
所述突变型荧光探针的核苷酸序列为：5’-TTGGGCGGGCCAAAC-3’；
所述野生型荧光探针的核苷酸序列为：5’-TTGGGCTGGCCAAAC-3’；
所述突变型荧光探针和野生型荧光探针的5’端第7位碱基均是经锁核酸修饰的碱基。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光探针B的5’端含有荧光报告基团FAM和/或CY3，3’端含有荧光淬灭基团BHQ-1和/或BHQ-2。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变型荧光探针的5’端含有荧光报告基团FAM，所述的突变型荧光探针的3’端含有荧光淬灭基团BHQ-1；
所述的野生型荧光探针的5’端含有荧光报告基团CY3，所述的野生型荧光探针的3’端含有荧光淬灭基团BHQ-2。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品；
所述的阳性质控品含有1％L858R突变的DNA，所述的阴性质控品含有EGFR基因野生型的DNA。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括反应预混液，所述的反应预混液包括：dATP、dCTP、dGTP、dTTP、镁离子、BSA、热启动Taq酶和单分子扩增增强剂；
所述的单分子扩增增强剂包括甜菜碱2M、体积比为0.2％的TritonX...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘一博，金鑫浩，任鲁风，张未来，于军，
申请(专利权)人：宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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