一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒和方法技术

本发明专利技术提供了一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒和方法，属于核酸检测领域。本发明专利技术公开的试剂盒包括：用于检测T790M位点的上游引物、下游引物；用于检测T790M位点的突变型荧光探针、野生型荧光探针、反应预混液、阳性质控品、阴性质控品。该试剂盒针对人类EGFR基因T790M位点设计了特定序列的引物和探针并优化了其反应体系，通过数字PCR平台的方法，实现对EGFR基因T790M位点突变的高灵敏度检测并同时获得突变的丰度。本发明专利技术提供的试剂盒和方法可检测多种来源样本，包括肿瘤、血液、唾液、血清中的核酸，扩大了该试剂盒和检测方法的使用范围，为肺癌T790M突变患者治疗提供用药指导。

A kit and method for detecting T790M mutation of EGFR gene

【技术实现步骤摘要】
一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒和方法
本专利技术属于核酸检测领域，具体涉及一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒和方法。
技术介绍
肺癌是全世界发病率和死亡率均列第一的恶性肿瘤，非小细胞肺癌(Non-smallcelllungcancer，NSCLC)占全部肺癌患者的80％以上，中国人群非小细胞肺癌患者最常见的致病突变来自EGFR基因(约占20％～40％)，EGFR突变中，主要集中于19号外显子缺失(约占45％)以及21号外显子L858R突变(约40％)。表皮生长因子受体(Epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)T790M突变是导致TKI(酪氨酸激酶抑制剂)治疗过程中出现获得性耐药性的主要因素，在首先使用埃罗替尼(Erlotinib)、吉非替尼(Gefitinib)或阿法替尼(Afatinib)9～13周后，约60％患者会出现该突变，因此检测该突变对于一线用药的疗效监控有着重要意义。近年来以血液等为样本基础的液体活检技术飞速发展。研究表明，当肿瘤组织难以获取时，无创、易采集的血液检测是EGFR基因突变分析合适的替代选择，并且血液检测在一定程度上能有效克服肿瘤异质性，可实现无创实时动态检测等，广泛应用于肺癌早筛和治疗中耐药性监测。目前血液中基因变异的检测技术主要有直接测序法和ARMS法，但直接测序法耗时长(一般需2-3天)，且灵敏度低，仅能检测突变比例在10-20％以上的突变。ARMS法主要用于对已知突变基因进行检测。以上两种检测方法均为定性检测，只能给出基因变异是否存在的结论，无法测定携带基因变异的DNA量的比例，难以进行定量检测，灵敏度也较差，仅能达到1％。当前基因定量的方法主要包括实时荧光定量PCR法、NGS法和数字PCR法，实时荧光定量PCR法基于Ct值，是一种相对定量的方法；NGS法有较好的灵敏度，同时也能检测未知突变，但是一次检测需要上万元费用，不利于单个明确的T790M目标的检测，给患者带来巨大的经济负担，而且NGS法花费的时间较长。数字PCR法基于单分子PCR方法来进行计数，是一种绝对定量的方法。数字PCR法作为第三代PCR技术，可以不依赖任何校准物或外标而是采用直接计数目标分子，即可确定目标分子的绝对数目，是对起始样品的绝对定量。但是由于血液中游离DNA含量极低，长度约70～200bp，其中突变相关游离DNA含量更少，约占总游离DNA含量的1％，普通试剂盒精度和灵敏度无法达到用于数字PCR检测血液中EGFR基因T790M位点突变的检测要求。基于此，本专利技术开发了一种基于数字PCR检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒，本专利技术提供的试剂盒不仅可以对来源于肿瘤和血液中的T790M位点突变的基因进行快速检测，其检测的高灵敏度还可以对来源于唾液和血清中T790M位点突变的基因进行检测，提供绝对定量，数据结果稳定可靠，能够更便捷地用于辅助诊断与临床治疗指导。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的问题，提供了一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒和方法，该试剂盒针对EGFR基因T790M位点设计了特定序列的引物和探针，在优化的反应体系中通过数字PCR平台的方法，实现对EGFR基因T790M位点突变的高灵敏度检测。本专利技术提供的试剂盒可检测的样本来源多样，包括肿瘤、血液、唾液、血清中的核酸，扩大了该试剂盒、反应体系和方法的使用范围。本专利技术采用如下技术方案施行：一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒，包括用于检测EGFR基因T790M位点的特异性引物，所述特异性引物包括：上游引物：5’-GGCATCTGCCTCACCTCCA-3’；下游引物：5’-GACATAGTCCAGGAGGCAGC-3’；所述试剂盒还包括用于检测EGFR基因T790M位点的荧光探针，所述荧光探针包括：与突变型DNA模板结合的突变型荧光探针：5’-GAGCTGCATGATGAG-3’；与野生型DNA模板结合的野生型荧光探针：5’-GAGCTGCGTGATGAG-3’；进一步地，所述检测EGFR基因T790M位点的突变型荧光探针和野生型荧光探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团；进一步地，所述荧光报告基团选自HEX、TexasRed、CY5、CY5.5、CY3、FAM或VIC；所述的淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3等；进一步地，所述突变型荧光探针连接的荧光报告基因为FAM，淬灭基团为BHQ1；所述野生型荧光探针连接的荧光报告基团为CY3，淬灭基团为BHQ2；进一步地，所述用于检测T790M位点的上游引物、下游引物和用于检测T790M位点的突变型荧光探针、野生型荧光探针，以引物探针混合液的形式存在，共同溶解于TE缓冲液中，制成引物探针混合溶液；在本专利技术所述的试剂盒中，用于检测T790M位点的上游引物的工作浓度为0.1-1μM，下游引物的工作浓度为0.1-1μM，用于检测T790M位点的突变型荧光探针的工作浓度为0.1-1μM，野生型荧光探针的工作浓度为0.1-1μM；优选地，检测T790M位点的上游引物的工作浓度为0.1-0.7μM，下游引物的工作浓度为0.1-0.7μM，用于检测T790M位点的突变型荧光探针的工作浓度为0.1-0.7μM，野生型荧光探针的工作浓度为0.1-0.7μM；更优选地，用于检测T790M位点的上游引物的工作浓度为0.1-0.5μM，下游引物的工作浓度为0.1-0.5μM，用于检测T790M位点的突变型荧光探针的工作浓度为0.1-0.5μM，野生型荧光探针的工作浓度为0.1-0.5μM；最优选地，用于检测T790M位点的上游引物的工作浓度为0.4μM，下游引物的工作浓度为0.4μM，用于检测T790M位点的突变型荧光探针的工作浓度为0.2μM，野生型荧光探针的工作浓度为0.2μM；试剂盒还包括反应预混液、无菌水、阳性质控品和阴性质控品；进一步地，所述反应预混液包括dATP、dCTP、dGTP、dUTP、镁离子、BSA、热启动Taq酶和扩增增强剂；进一步地，所述扩增强剂包括焦磷酸酶和TritonX-100；进一步地，所述焦磷酸酶的终浓度为0.5-2U，所述TritonX-100的终浓度为0.05％-2％；进一步地，所述阳性质控品的制备方法为：EGFR基因T790M位点野生型和突变型的序列各200bp，合成后，分别装入质粒载体pET-23d(+)(Promega)。使用Qubit3.0进行定量，计算两种类型质粒的拷贝数浓度，根据拷贝数比例1:3000，1:2000，1:1000，1:500，1:200，1:100，1:50，1:10混合两种质粒，之后通过超声将质粒混合物打断为150-210bp的片段，定量到20ng/μL，作为梯度阳性质控品。阴性质控品由上述含有野生型的质粒单独构成，然后采用同样方法打断为150-210bp的片段，定量到20ng/μL，作为阴性质控品；以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒，其特征在于，含有以下物质：/n(A)用于检测T790M位点的上游引物、下游引物，所述引物的序列为：/n上游引物：5’-GGCATCTGCCTCACCTCCA-3’；/n下游引物：5’-GACATAGTCCAGGAGGCAGC-3’；/n(B)用于检测T790M位点的突变型荧光探针、野生型荧光探针，所述荧光探针的序列为：/n突变型荧光探针：5’-GAGCTGCATGATGAG-3’；/n野生型荧光探针：5’-GAGCTGCGTGATGAG-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒，其特征在于，含有以下物质：
(A)用于检测T790M位点的上游引物、下游引物，所述引物的序列为：
上游引物：5’-GGCATCTGCCTCACCTCCA-3’；
下游引物：5’-GACATAGTCCAGGAGGCAGC-3’；
(B)用于检测T790M位点的突变型荧光探针、野生型荧光探针，所述荧光探针的序列为：
突变型荧光探针：5’-GAGCTGCATGATGAG-3’；
野生型荧光探针：5’-GAGCTGCGTGATGAG-3’。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变型荧光探针和野生型荧光探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光报告基团选自HEX、TexasRed、CY5、CY5.5、CY3、FAM或VIC；所述的淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述突变型荧光探针连接的荧光报告基因为FAM，淬灭基团为BHQ1；所述野生型荧光探针连接的荧光报告基团为CY3，淬灭基团为BHQ2。


5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测T790M位点的上游引物、下游引物和用于检测T790M位点的突变型荧光探针、野生型荧光探针，以引物探针混合液的形式存在，共同溶解于TE缓冲液中，制成引物探针混合溶液。


6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括反应预混液、阳性质控品和阴性质控品，所述反应预混液包括dAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘一博，金鑫浩，任鲁风，张未来，于军，
申请(专利权)人：宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33