一种植酸酶突变体制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种植酸酶突变体、编码该植酸酶突变体的DNA分子、载体、宿主细胞。所述植酸酶突变体的最适作用pH值为5.5，且在中性pH条件下的耐受性得到显著提高，在pH6.0条件下，所述突变体的相对酶活达到72.80%‑79.25%，在pH6.5条件下，所述突变体的相对酶活仍能达到32.99%‑40.95%，取得了意料不到的技术效果，有利于植酸酶在水产饲料中的广泛应用。

A mutant of Phytase

【技术实现步骤摘要】
一种植酸酶突变体
本专利技术涉及蛋白质工程改造
，具体涉及一种植酸酶突变体及其应用。
技术介绍
植酸，又名肌醇六磷酸或环己六醇磷酸酯，广泛存在于植物籽实中，是植物性饲料中磷元素的主要储存形式，但植酸磷不能被动物直接吸收利用，必须在消化道内先水解为无机磷酸盐。水产动物尤其是鱼类消化系统中缺乏内源性植酸酶，无法利用饲料中的植酸磷，大部分随粪便排出，造成严重的水环境污染，同时造成磷的浪费。而水产动物对饲料中磷的需要量又高于畜禽，特别是鲤科鱼类属无胃鱼，没有胃酸分泌，通常采用饲料中添加磷酸氢钙或磷酸二氢钙等方法来满足水产动物机体对磷的营养需求。同时，植酸通常与一些二价或三价阳离子，如Ca2+、Zn2+、Fe2+等形成不溶性盐类，阻碍肠道对矿物元素的吸收。在酸性或近中性环境中植酸还可以与蛋白质形成络合物，影响蛋白质的吸收利用，与一些蛋白消化酶类等结合，降低了其活性。因此植酸也被认定为抗营养物质，它不仅造成饲料原料的浪费，无形中增加了养殖成本，还导致水产动物粪便中含有大量的氮磷和矿物质离子化合物，严重污染水环境。植酸酶广泛存在于动物、植物和微生物中，是一类能将植酸及其盐类催化水解成肌醇和磷酸的酶的总称，属磷酸单酯水解酶。植酸酶作为环保促生长型饲料添加剂，可提高水产动物饲料中磷的利用率，减少水产动物养殖中磷对水环境的污染和水产饲料中矿物质磷的添加量，同时能提高植物蛋白和植物饲料能量矿物质利用率，从而节约饲料资源，降低饲料成本，符合我国两型社会建设要求，其在水产健康养殖中具有广阔的应用前景。酸性植酸酶适用于胃pH呈酸性的单胃动物以及少数鱼类如虹蹲等，但不适用于消化道为中性的淡水鲤科鱼类和畜禽消化道中呈中性的部位。而中性植酸酶可以应用于消化道无胃、肠道pH呈中性的淡水鲤科鱼类饲料，对提高鱼类的生产效益、品质及降低饲料中植酸磷对环境的污染有重要意义。此外，中性植酸酶还可在pH值逐渐升高至中性的单胃畜禽动物肠道中起作用，延长植酸酶在整个动物胃肠道中的作用时间，提高其有效性。但目前现有的植酸酶产品在中性pH条件下的酶活水平普遍偏低，尚不能满足水产养殖的要求。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种植酸酶突变体，其在中性pH条件下的酶活水平得到显著提高，可广泛应用于水产养殖饲料领域。本专利技术提供了一种植酸酶突变体，其具有(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的氨基酸序列：（Ⅰ）与植酸酶的氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少90%同源性的序列；（Ⅱ）具有所述植酸酶的至少一个免疫表位，且所述植酸酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。在本专利技术的一些实施例中，所述取代为取代1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸。在本专利技术的一些实施例中，植酸酶突变体的氨基酸序列与植酸酶的氨基酸序列具有至少95%同源性的序列。在本专利技术的另一些实施例中，植酸酶突变体的氨基酸序列与植酸酶的氨基酸序列具有至少96%同源性的序列。在本专利技术的另一些实施例中，植酸酶突变体的氨基酸序列与植酸酶的氨基酸序列具有至少97%同源性的序列。在本专利技术的另一些实施例中，植酸酶突变体的氨基酸序列与植酸酶的氨基酸序列具有至少98%同源性的序列。在本专利技术的另一些实施例中，植酸酶突变体的氨基酸序列与植酸酶的氨基酸序列具有至少99%同源性的序列。在本专利技术的一些实施例中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代为第253位、第254位或第327位中的任意一个或两个或三个氨基酸被取代。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代为第253位氨基酸由Gln变为Val，第254位氨基酸由Phe变为Trp，第327位氨基酸由Thr变为Leu。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代还包括第211位、第225位或第266位中的任意一个或两个或三个氨基酸被取代。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代还包括第211位氨基酸由Val变为Trp，第225位氨基酸由Gln变为Tyr，第266位氨基酸由Ser变为Pro。在本专利技术的另一些实施例中，植酸酶突变体具有如SEQIDNO:3或SEQIDNO:4或SEQIDNO:5或SEQIDNO:7或SEQIDNO:8或SEQIDNO:9或SEQIDNO:10或SEQIDNO:11或SEQIDNO:12或SEQIDNO:13所示的氨基酸序列。本专利技术还提供了编码上述的植酸酶突变体的DNA分子。本专利技术还提拱了具有上述DNA分子的重组表达载体。本专利技术还提供了一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。在本专利技术的一些实施例中，所述宿主细胞为毕赤酵母（Pichiapastoris），木霉（Trichodermasp.）或曲霉（Aspergillussp.）。与植酸酶PHY-M相比，本专利技术提供的植酸酶突变体最适作用pH值为5.5，普遍向中性条件偏移了0.5个单位，且在中性pH条件下的耐受性得到显著提高。在pH6.0条件下，所述植酸酶突变体的相对酶活达到72.80%-79.25%，提高了29.3%-36.0%；在pH6.5条件下，所述植酸酶突变体的相对酶活仍能达到32.99%-40.95%，而植酸酶PHY-M的相对酶活仅有10.95%，取得了意料不到的技术效果。本专利技术提供的植酸酶突变体PHY4，PHY5，PHY6，PHY7，PHY8，PHY9和PHY10的耐热性均得到显著提高；90℃处理3min后，植酸酶的酶活残留率普遍提高了10%-60.81%，其中植酸酶突变体PHY10的耐热性最高，酶活残留率高达80.93%。所述植酸酶突变体可广泛应用于水产饲料领域，前景广阔。具体实施方式本专利技术公开了一种植酸酶突变体、编码该植酸酶突变体的DNA分子、载体、宿主细胞，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。本专利技术具体实施例所使用的实验材料和试剂如下：菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9K、Amp、G418购自Invitrogen公司。酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植酸酶突变体，其特征在于，其具有(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的氨基酸序列：/n(Ⅰ) 与植酸酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少90%同源性的序列；/n(Ⅱ) 具有所述植酸酶的至少一个免疫表位，且所述植酸酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；/n所述取代为取代1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种植酸酶突变体，其特征在于，其具有(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的氨基酸序列：
(Ⅰ)与植酸酶的氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少90%同源性的序列；
(Ⅱ)具有所述植酸酶的至少一个免疫表位，且所述植酸酶的氨基酸序列SEQIDNO:1经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
所述取代为取代1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸。


2.如权利要求1所述的植酸酶突变体，其特征在于，所述取代为第253位、第254位或第327位中的任意一个或两个或三个氨基酸被取代。


3.如权利要求2所述的植酸酶突变体，其特征在于，所述取代为第253位氨基酸由Gln变为Val，第254位氨基酸由Phe变为Trp，第327位氨基酸由Thr变为Leu。


4.如权利要求3所述的植酸酶突变体，其特征在于，所述取代还包括第211位、第225位或第266位中的任意一个或两个或三个氨基酸被取代。


5.如权利要求4所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴秀秀，李玉强，刘扬，黄亦钧，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，潍坊康地恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37