新型突变型PTE酶制造技术

技术编号：24018427 阅读：41 留言：0更新日期：2020-05-02 04:19

本发明专利技术涉及具有经改善的稳定性和活性的突变型磷酸三酯酶，以及其用途，尤其是用于降解有机磷化合物的用途。

Novel mutant PTE enzyme

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【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型突变型PTE酶本专利技术涉及具有经改善的稳定性和活性的突变型磷酸三酯酶，以及其用途，尤其是用于降解有机磷化合物的用途。有机磷(OP)杀昆虫剂已成为当今使用最广泛的杀昆虫剂。OP在农业中、在住所内、在园艺情景下以及在兽医学领域中使用。由于这些化合物抑制某些酯酶，因此暴露于OP可以以多种方式导致严重的毒性。由OP对乙酰胆碱酯酶(在哺乳动物中神经系统的关键酶)的不可逆的抑制在所有脊椎动物中都引起严重的损害。该酶的功能丧失导致在机体的各种不同区室中乙酰胆碱的积累，从而引起肌肉收缩、麻痹和呼吸窘迫。与呼吸系统衰竭相组合的肺分泌物增加是与有机磷中毒相关的死亡的常见原因。在第二次世界大战期间也开发了一些OP：具有增加的毒性和/或更好的稳定性的OP的发现已导致开发出化学武器例如沙林气、索曼、塔崩或VX。此外，由于容易得到并且相比于化学武器的OP而言毒性不低，因而OP杀昆虫剂对人群构成了重大风险。离我们更近的是，目前的恐怖主义风险已使得当局设想借助于有机磷物质例如沙林气的化学攻击的场景，并且面对这些日益增长的威胁，解毒剂的开发从未如此紧迫。由于这些分子的疏水特点，OP容易通过吸入、通过摄入或甚至通过皮肤渗透而被机体吸收。中毒的发生率取决于化合物的吸收率。急性OP中毒的症状在暴露期间或之后表现出来，并且根据暴露类型，接下来持续数分钟或数小时。通过吸入的暴露引起中毒症状的最快速的表现，随后为胃肠道，和最后为通过皮肤接触的中毒。防护服和面罩并不总是提供足够的针对OP的防护。在经由皮肤、衣服或毛发而因OP中毒...

【技术保护点】
1.序列SEQ ID NO:2所示的突变型PTE酶，其衍生自具有序列SEQ ID NO:1的对硫磷水解酶，所述突变型PTE酶与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性并且相对于序列SEQ ID NO:1而言包含至少下列7个突变：/n-苏氨酸T被脯氨酸P置换，在位置13处，/n-异亮氨酸I被缬氨酸V置换，在位置14处，/n-丙氨酸A被丝氨酸S置换，在位置60处，/n-丝氨酸S被精氨酸R置换，在位置79处，/n-酪氨酸Y被组氨酸H置换，在位置124处，/n-异亮氨酸I被缬氨酸V置换，在位置218处，/n-谷氨酰胺Q被精氨酸R置换，在位置258处；/n和与上述序列SEQ ID NO:2具有至少90％的同一性百分比的突变型酶，条件是在所述突变型酶的序列中存在7个上述突变。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170717 FR 17/567761.序列SEQIDNO:2所示的突变型PTE酶，其衍生自具有序列SEQIDNO:1的对硫磷水解酶，所述突变型PTE酶与SEQIDNO:1具有至少90％的同一性并且相对于序列SEQIDNO:1而言包含至少下列7个突变：
-苏氨酸T被脯氨酸P置换，在位置13处，
-异亮氨酸I被缬氨酸V置换，在位置14处，
-丙氨酸A被丝氨酸S置换，在位置60处，
-丝氨酸S被精氨酸R置换，在位置79处，
-酪氨酸Y被组氨酸H置换，在位置124处，
-异亮氨酸I被缬氨酸V置换，在位置218处，
-谷氨酰胺Q被精氨酸R置换，在位置258处；
和与上述序列SEQIDNO:2具有至少90％的同一性百分比的突变型酶，条件是在所述突变型酶的序列中存在7个上述突变。

2.根据权利要求1的突变型PTE酶，其中至少2个从占据下列位置的氨基酸中选择的氨基酸是经突变的：
-在位置45处的氨基酸，
-在位置48处的氨基酸，
-在位置74处的氨基酸，
-在位置100处的氨基酸，
-在位置141处的氨基酸，
-在位置153处的氨基酸，
-在位置177处的氨基酸，
-在位置201处的氨基酸，
-在位置222处的氨基酸，
-在位置225处的氨基酸，
-在位置235处的氨基酸，
-在位置238处的氨基酸，
-在位置239处的氨基酸，
-在位置240处的氨基酸，
-在位置242处的氨基酸，
-在位置271处的氨基酸，
-在位置276处的氨基酸，
-在位置277处的氨基酸，
-在位置287处的氨基酸，
-在位置310处的氨基酸，
所述位置相对于序列SEQIDNO:1而言来进行定义，特别地，其中在上述位置处的突变选自下述列表：
-在位置45处：赖氨酸K被丙氨酸A置换，
-在位置48处：丙氨酸A被缬氨酸V或甲硫氨酸M置换，
-在位置74处：异亮氨酸I被半胱氨酸C或丙氨酸A置换，
-在位置100处：苯丙氨酸F被谷氨酸E或缬氨酸V置换，
-在位置141处：苏氨酸T被天冬酰胺N置换，
-在位置153处：赖氨酸K被精氨酸R置换，
-在位置177处：甘氨酸G被天冬氨酸D置换，
-在位置201处：天冬氨酸D被甘氨酸G置换，
-在位置222处：组氨酸H被甘氨酸G或谷氨酰胺Q置换，
-在位置225处：组氨酸H被酪氨酸Y置换，
-在位置235处：丝氨酸S被甲硫氨酸M置换，
-在位置238处：丙氨酸A被缬氨酸V或丝氨酸S置换，
-在位置239处：亮氨酸L被色氨酸W置换，
-在位置240处：亮氨酸L被甲硫氨酸M置换，
-在位置242处：异亮氨酸I被天冬酰胺N置换，
-在位置271处：亮氨酸L被苏氨酸T置换，
-在位置276处：丝氨酸S被亮氨酸L置换，
-在位置277处：酪氨酸Y被色氨酸W置换，
-在位置287处：精氨酸R被丝氨酸S置换，
-在位置310处：脯氨酸P被丝氨酸S置换。

3.根据权利要求1至2中任一项的突变型PTE酶，其具有至少2个突变，在位置225和271处。

4.根据权利要求2的突变型PTE酶，其是序列SEQIDNO:3所示的，其中所述至少2个突变为下列突变：
-在位置225处：组氨酸H被酪氨酸Y置换，
-在位置271处：亮氨酸L被苏氨酸T置换。

5.根据权利要求1至2中任一项的突变型PTE酶，其具有至少8个突变，在位置74、100、222、225、238、240、242和276处，特别地其是序列SEQIDNO:4所示的，其中所述至少8个突变为下列突变：
-在位置74处：异亮氨酸I被半胱氨酸C置换，
-在位置100处：苯并氨酸F被缬氨酸V置换，
-在位置222处：组氨酸H被谷氨酰胺Q置换，
-在位置225处：组氨酸H被酪氨酸Y置换，
-在位置238处：丙氨酸A被缬氨酸V置换，
-在位置240处：亮氨酸L被甲硫氨酸M置换，
-在位置242处：异亮氨酸I被天冬酰胺N置换，
-在位置276处：丝氨酸S被亮氨酸L置换。

6.根据权利要求1至2中任一项的突变型PTE酶，其具有至少9个突变，在位置45、48、100、141、153、222、242、287和310处，特别地其是序列SEQIDNO:5所示的，其中所述至少9个突变为下列突变：
-在位置45处：赖氨酸K被丙氨酸A置换，
-在位置48处：丙氨酸A被缬氨酸V置换，
-在位置100处：苯并氨酸F被谷氨酸E置换，
-在位置141处：苏氨酸T被天冬酰胺N置换，
-在位置153处：赖氨酸K被精氨酸R置换，
-在位置222处：组氨酸H被甘氨酸G置换，
-在位置242处：异亮氨酸I被天冬酰胺N置换，
-在位置287处：精氨酸R被丝氨酸S置换，
-在位置310处：脯氨酸P被丝氨酸S置换。

7.根据权利要求1至2中任一项的突变型PTE酶，其具有至少11个突变，在位置45、48、100、141、153、177、201、222、242、277和287处，特别地其是序列SEQIDNO:6所示的，所述至少11个突变为下列突变：
-在位置45处：赖氨酸K被丙氨酸A置换，
-在位置48处：丙氨酸A被缬氨酸V置换，
-在位置100处：苯并氨酸F被谷氨酸E置换，
-在位置141处：苏氨酸T被天冬酰胺N置换，
-在位置153处：赖氨酸K被精氨酸R置换，
-在位置177处：甘氨酸G被天冬氨酸D置换，
-在位置201处：天冬氨酸D被甘氨酸G置换，
-在位置222处：组氨酸H被甘氨酸G置换，
-在位置242处：异亮氨酸I被天冬酰胺N置换，
-在位置277处：酪氨酸Y被色氨酸W置换，
-在位置287处：精氨酸R被丝氨酸S置换。

8.根据权利要求1至2中任一项的突变型PTE酶，其具有至少12个突变，在位置45、48、74、100、141、153、177、201、222、242、277和287处，特别地其是序列SEQIDNO:7所示的，其中所述至少12个突变为下列突变：
-在位置45处：赖氨酸K被丙氨酸A置换，
-在位置48处：丙氨酸A被缬氨酸V置换，
-在位置74处：异亮氨酸I被丙氨酸A置换，
-在位置100处：苯并氨酸F被谷氨酸E置换，
-在位置141处：苏氨酸T被天冬酰胺N置换，
-在位置153处：赖氨酸K被精氨酸R置换，
-在位置177处：甘氨酸G被天冬氨酸D置换，
-在位置201处：天冬氨酸D被甘氨酸G置换，
-在位置222处：组氨酸H被甘氨酸G置换，
-在位置242处：异亮氨酸I被天冬酰胺N置换，
-在位置277处：酪氨酸Y被色氨酸W置换，
-在位置287处：精氨酸R被丝氨酸S置换。

9.根据权利要求1至2中任一项的突变型PTE酶，其具有至少13个突变，在位置45、48、100、141、153、177、201、222、238、239、242、277和287处，特别地其是序列SEQIDNO:8所示的，其中所述至少13个突变为下列突变：
-在位置45处：赖氨酸K被丙氨酸A置换，
-在位置48处：丙氨酸A被甲硫氨酸M置换，
-在位置100处：苯并氨酸F被谷氨酸E置换，
-在位置141处：苏氨酸T被天冬酰胺N置换，
-在位置153处：赖氨酸K被精氨酸R置换，
-在位置177处：甘氨酸G被天冬氨酸D置换，
-在位置201处：天冬氨酸D被甘氨酸G置换，
-在位置222处：组氨酸H被甘氨酸G置换，
-在位置238处：丙氨酸A被丝氨酸S置换，
-在位置239处：亮氨酸L被色氨酸W置换，
-在位置242处：异亮氨酸I被天冬酰胺N置换，
-在位置277处：酪氨酸Y被色氨酸W置换，
-在位置287处：精氨酸R被丝氨酸S置换。

10.根据权利要求1至2中任一项的突变型PTE酶，其具有至少14个突变，在位置45、48、74、100、141、153、177、201、222、238、239、242、277和287处，特别地其是序列SEQIDNO:9所示的，其中所述至少14个突变为下列突变：
-在位置45处：赖氨酸K被丙氨酸A置换，
-在位置48处：丙氨酸A被甲硫氨酸M置换，
-在位置74处：异亮氨酸I被丙氨酸A置换，
-在位置100处：苯并氨酸F被谷氨酸E置换，
-在位置141处：苏氨酸T被天冬酰胺N置换，
-在位置153处：赖氨酸K被精氨酸R置换，
-在位置177处：甘氨酸G被天冬氨酸D置换，
-在位置201处：天冬氨酸D被甘氨酸G置换，
-在位置222处：组氨酸H被甘氨酸G置换，
-在位置238处：丙氨酸A被丝氨酸S置换，
-在位置239处：亮氨酸L被色氨酸W置换，
-在位置242处：异亮氨酸I被天冬酰胺N置换，
-在位置277处：酪氨酸Y被色氨酸W置换，
-在位置287处：精氨酸R被丝氨酸S置换。

11.根据权利要求1至2中任一项的突变型PTE酶，其具有至少14个突变，在位置45、48、100、141、153、177、201、222、235、238、239、242、277和287处，特别地其是序列SEQIDNO:10所示的，其中所述至少14个突变为下列突变：
-在位置45处：赖氨酸K被丙氨酸A置换，
-在位置48处：丙氨酸A被甲硫氨酸M置换，
-在位置100处：苯并氨酸F被谷氨酸E置换，
-在位置141处：苏氨酸T被天冬酰胺N置换，
-在位置153处：赖氨酸K被精氨酸R置换，
-在位置177处：甘氨酸G被天冬氨酸D置换，
-在位置201处：天冬氨酸D被甘氨酸G置换，
-在位置222处：组氨酸H被甘氨酸G置换，
-在位置235处：丝氨酸S被甲硫氨酸M置换，
-在位置238处：丙氨酸A被丝氨酸S置换，
-在位置239处：亮氨酸L被色氨酸W置换，
-在位置242处：异亮氨酸I被天冬酰胺N置换，
-在位置277处：酪氨酸Y被色氨酸W置换，
-在位置287处：精氨酸R被丝氨酸S置换。

【专利技术属性】
技术研发人员：E·夏布里埃，D·杜德，M·埃利亚斯，
申请(专利权)人：地中海感染基金会，国家健康与医学研究院，基因与绿色TK公司，公共救济事业局马赛医院，国家科研中心，艾克斯·马赛大学，
类型：发明
国别省市：法国;FR

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