本发明专利技术提供纯化包括选自本文描述的SEQ ID NO:1‑251的GCC激动剂序列的肽的方法。所述方法包括：溶剂交换步骤，然后冷冻干燥(冻干)步骤。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求提交于2013年6月5日的美国临时申请USSN61/831,402的优先权和权益，其内容通过引用以其整体结合到本文中。专利
本专利技术涉及纯化可用于制备治疗和预防各种疾病和病症的制剂的鸟苷酸环化酶C肽激动剂的方法。专利技术背景鸟苷酸环化酶C是鸟苷酸环化酶的跨膜形式，其表达在各种细胞包括胃肠道上皮细胞上(综述于Vaandrager2002Mol.Cell.Biochem.230:73-83)。其最初作为由肠道细菌分泌且引起腹泻的热稳定毒素(ST)肽的肠道受体而被发现。ST肽与从肠粘膜和尿液中分离的两种肽鸟苷肽和尿鸟苷素(uroguanylin)共有相似的氨基酸一级结构(Currie等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA89:947-951(1992);Hamra等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA90:10464-10468(1993);Forte,L.,Reg.Pept.81:25-39(1999);Schulz等,Cell63:941-948(1990);Guba等,Gastroenterology111:1558-1568(1996);Joo等,Am.J.Physiol.274:G633-G644(1998))。在肠道中，鸟苷肽和尿鸟苷素充当体液和电解质平衡的调节剂。响应于高口服盐摄入，这些肽释放进入肠腔，在肠腔中它们结合至定位于肠细胞(小肠和结肠的单层柱状上皮细胞)的管腔膜上的鸟苷酸环化酶C。鸟苷肽与鸟苷酸环化酶C的结合经由环单磷酸鸟苷(cGMP)的增加引发的复杂细胞内信号传递级联而诱导电解质和水排泄进入肠腔。由鸟苷肽引发的cGMP介导的信号传递对于肠的正常运作是至关重要的。在这一过程中出现的任何异常现象都会导致胃肠功能病症，诸如肠易激综合症(IBS)和炎性肠病。炎性肠病是一组病症的统称，这种病症引起肠道发展成炎症，其特征在于组织发红和发肿。实例包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。克罗恩氏病是一种严重的炎性疾病，这种疾病主要影响回肠和结肠，同时还可以发生在胃肠道的其他部分。溃疡性结肠炎特有地是结肠、大肠的炎性疾病。克罗恩氏病可以涉及肠道的所有层，并且在几片患病的肠道部分之间可以存在正常健康的肠，与克罗恩氏病不同，溃疡性结肠炎以一种连续的方式仅作用在结肠最里面的内衬(粘膜)。根据涉及胃肠道的何部分，克罗恩氏病可以称为回肠炎、局限性回肠炎、结肠炎等等。克罗恩氏病和溃疡性结肠炎与结肠痉挛综合症或者肠易激综合症不同，结肠痉挛综合症或者肠易激综合症是胃肠道的动力病症。肠胃炎症可以是慢性状况。据估计，多达1,000,000美国人都患有炎性肠病，其中男性患者和女性患者好像同样受影响。大多数病例在30岁之前被诊断出来，但更多疾病在六十、七十或者生命的更大的年龄阶段发生。IBS和慢性特发性便秘是可引起极度肠不适和痛苦但与炎性肠病不同的病理状况，IBS不引起肠组织的严重炎症或改变，并且认为其不增加患结肠直肠癌的风险。过去，炎性肠病、乳糜泻和IBS被认为是完全独立的病症。现在，根据IBS中的炎症(虽然低度)以及IBS与乳糜泻之间重叠的症状的描述，该论点已遭到质疑。急性细菌性胃肠炎是迄今鉴定的随后发生感染后肠易激综合症的最强风险因素。临床风险因素包括延长的急性疾病和呕吐的不存在。遗传上确定的对炎性刺激的易感性也可以是患肠易激综合症的风险因素。潜在的病理生理学显示增加的肠通透性和低度炎症以及改变的动力和内脏敏感性(visceralsensitivity)。血清素(5-羟色胺[5-HT])是肠功能的关键调节剂，已知其在IBS的病理生理学中起着主要作用。5-HT的活性受cGMP调节。尽管IBS和炎性肠病(IBD)的确切原因是未知的，但是胃肠粘膜的持续更新的过程的中断可能促进IBD的疾病病理和IBS加重。胃肠道内衬的更新过程是有效且动态的过程，该过程包括对不需要的受损细胞持续的增殖和补充。胃肠道粘膜内衬细胞的增殖速率非常高，仅次于造血系统。胃肠道体内平衡取决于肠道粘膜内衬上皮细胞的增殖和程序性细胞死亡(细胞凋亡)两者。细胞不断的从绒毛损失进入肠道内腔，并通过在隐窝处以基本上相等的速率通过细胞增殖，随后其向上移动到绒毛而进行补充。肠上皮的细胞增殖和细胞凋亡的速率可在许多环境中(例如响应于生理学刺激诸如衰老、炎性信号、激素、肽、生长因子、化学品和膳食习惯)增加或减小。此外，增加的增殖速率通常与周转时间的减少和增殖区域的扩大相关。增殖指数在病理状态诸如溃疡性结肠炎和其他肠胃病症中高得多。肠增生是胃肠炎症的主要促进因素。细胞凋亡和细胞增殖一起调节细胞数量且确定增殖指数。降低的细胞凋亡速率通常与异常生长、发炎、和赘生转化有关。因此，增殖增加和/或细胞死亡减少可以增加肠道组织的增殖指数，其进而可以导致胃肠道炎性疾病。除了尿鸟苷素和鸟苷肽作为肠液和离子分泌的调节剂的作用外，这些肽还可通过维持增殖与细胞凋亡之间的平衡参与胃肠粘膜的持续更新。例如，尿鸟苷素和鸟苷肽似乎可以通过控制细胞离子流动而促进细胞凋亡。考虑到炎性状况在西方社会的流行率，存在改善炎性状况，特别是胃肠道的炎性状况治疗选择的需要。鸟苷酸环化酶C激动剂(“GCC激动剂”)的肽激动剂描述于美国专利号7,041,786、7,799,897和美国专利申请公开号US2009/0048175、US2010/0069306、US2010/0120694、US2010/0093635和US2010/0221329以及WO2012/118972。然而，先前的用于药物应用的肽的合成呈现了大量的特定问题，例如总体低的得率(例如少于10%)和/或高水平的杂质(例如由在合成或纯化期间使用的有机溶剂导致的污染物，和在例如纯化期间产生的降解产物或拓扑异构体)。专利技术简述在一个方面，本专利技术源自解决在用于药物应用的肽GCC激动剂的纯化过程(例如描述于WO2012/118972的冻干过程和沉淀过程)期间遇到的各种意想不到的问题的努力。本文描述的方法提供对这些问题的解决方案。在一个方面，本专利技术提供包含GCC激动剂序列的纯化的肽，所述序列选自SEQIDNO:1、9和104，其中所述纯化的肽具有以下特征：a)具有不大于0.1g/mL的堆积密度；b)包含少于50ppm乙酰胺；c)少于0.3%α-Asp-9-plenacanatide。纯化的肽可具有一个或多个以下特征。例如，所述肽在25℃下稳定至少3个月。例如，当用液体分散剂通过光散射测量时，所述肽具有下述粒径分布：D10值为约2本文档来自技高网...
【技术保护点】
纯化的肽，其包含选自SEQ ID NO: 1、9和104的GCC激动剂序列，其中所述纯化的肽具有以下特征：a) 具有不大于0.1 g/mL的堆积密度；b) 包含少于50 ppm乙酰胺；和d) 少于0.3% α‑Asp‑9‑plenacanatide (RRT 1.33)。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.06.05 US 61/8314021.纯化的肽，其包含选自SEQIDNO:1、9和104的GCC激动剂序列，其中所述纯化的肽
具有以下特征：
a)具有不大于0.1g/mL的堆积密度；
b)包含少于50ppm乙酰胺；和
d)少于0.3%α-Asp-9-plenacanatide(RRT1.33)。
2.权利要求1的纯化的肽，其中所述肽在25℃下稳定至少3个月。
3.权利要求1的纯化的肽，其中所述肽具有特征为以下的粒径分布：
当用液体分散剂通过光散射测量时
a)D10值为约2-15μm；
b)D50值为约15-50μm；和
c)D90值为约40-80μm。
4.权利要求1的纯化的肽，其中所述肽具有不大于0.06g/mL、不大于0.05g/mL或不
大于0.04g/mL的堆积密度。
5.权利要求1或2的纯化的肽，其中所述肽具有不少于95%、不少于96%或不少于97%的色
谱纯度。
6.权利要求1-5中任一项的纯化的肽，其中所述肽基本上不含水。
7.权利要求6的纯化的肽，其中所述水不大于10%、不大于9%、不大于8%、不大于7%、不大
于6%或不大于5%。
8.权利要求1-7中任一项的纯化的肽，其中所述肽还基本上不含选自乙腈、醇、铵、乙酸
盐和TFA的一种或多种杂质。
9.权利要求8的纯化的肽，其中所述肽包含少于300ppm乙腈。
10.权利要求8或9的纯化的肽，其中所述肽包含少于0.1%TFA。
11.权利要求8-10中任一项的纯化的肽，其中所述肽包含少于1000ppm异丙醇。
12.权利要求8-11中任一项的纯化的肽，其中所述肽包含少于600ppm异丙醇。
13.权利要求8-12中任一项的纯化的肽，其中所述肽包含少...
【专利技术属性】
技术研发人员：K沙鲁布海，S科米斯基，R冯，J拜，R张，J贾，J周，Q赵，G张，
申请(专利权)人：辛纳吉制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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