制备鸟苷酸环化酶C激动剂的方法技术

本发明专利技术提供了制备鸟苷酸环化酶C激动剂的方法，具体而言制备包含选自本文所述的SEQ ID NOs:1‑249的GCC激动剂序列的肽的方法。

Process for the preparation of guanylate cyclase C agonists

The present invention provides a method for preparing guanylate cyclase C agonists, methods of preparation include specifically selected from the SEQ ID NOs:1 249 GCC agonist peptide sequence.

【技术实现步骤摘要】
制备鸟苷酸环化酶C激动剂的方法本申请是申请日为2012年3月1日的中国专利申请201280021221.6“制备鸟苷酸环化酶C激动剂的方法”的分案申请。相关申请本申请要求2011年3月1日提交的美国临时申请号61/447,891(其内容整体通过引用并入)的权益和优先权。
本专利技术涉及制备可用于治疗和预防各种疾病和病症的鸟苷酸环化酶C肽激动剂的方法。
技术介绍
鸟苷酸环化酶C是鸟苷酸环化酶的跨膜形式，其表达在各种细胞包括胃肠道上皮细胞上(综述于Vaandrager2002Mol.Cell.Biochem.230:73-83)。其最初作为由肠道细菌分泌且引起腹泻的热稳定毒素(ST)肽的肠道受体而被发现。ST肽与从肠粘膜和尿液中分离的两种肽鸟苷肽和尿鸟苷素(uroguanylin)共有相似的氨基酸一级结构。在肠道中，鸟苷肽和尿鸟苷素充当体液和电解质平衡的调节剂。响应于高口服盐摄入，这些肽释放进入肠腔，在肠腔中它们结合至定位于肠细胞(小肠和结肠的单层柱状上皮细胞)的管腔膜上的鸟苷酸环化酶C。鸟苷肽与鸟苷酸环化酶C的结合经由环单磷酸鸟苷(cGMP)的增加引发的复杂细胞内信号传递级联而诱导电解质和水排泄进入肠腔。由鸟苷肽引发的cGMP介导的信号传递对于肠的正常运作是至关重要的。在这一过程中出现的任何异常现象都会导致胃肠功能病症，诸如肠易激综合症(IBS)和炎性肠病。炎性肠病是一组病症的统称，这种病症引起肠道发展成炎症，其特征在于组织发红和发肿。实例包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。克罗恩氏病是一种严重的炎性疾病，这种疾病主要影响回肠和结肠，同时还可以发生在胃肠道的其他部分。溃疡性结肠炎特有地是结肠、大肠的炎性疾病。克罗恩氏病可以涉及肠道的所有层，并且在几片患病的肠道部分之间可以存在正常健康的肠，与克罗恩氏病不同，溃疡性结肠炎以一种连续的方式仅作用在结肠最里面的内衬(粘膜)。根据涉及胃肠道的何部分，克罗恩氏病可以称为回肠炎、局限性回肠炎、结肠炎等等。克罗恩氏病和溃疡性结肠炎与结肠痉挛综合症或者肠易激综合症不同，结肠痉挛综合症或者肠易激综合症是胃肠道的动力病症。肠胃炎症可以是慢性状况。据估计，多达1,000,000美国人都患有炎性肠病，其中男性患者和女性患者好像同样受影响。大多数病例在30岁之前被诊断出来，但更多疾病在六十、七十或者生命的更大的年龄阶段发生。IBS和慢性特发性便秘是可引起极度肠不适和痛苦但与炎性肠病不同的病理状况，IBS不引起肠组织的严重炎症或改变，并且认为其不增加患结肠直肠癌的风险。过去，炎性肠病、乳糜泻和IBS被认为是完全独立的病症。现在，根据IBS中的炎症(虽然低度)以及IBS与乳糜泻之间重叠的症状的描述，该论点已遭到质疑。急性细菌性胃肠炎是迄今鉴定的随后发生感染后肠易激综合症的最强风险因素。临床风险因素包括延长的急性疾病和呕吐的不存在。遗传上确定的对炎性刺激的易感性也可以是患肠易激综合症的风险因素。潜在的病理生理学显示增加的肠通透性和低度炎症以及改变的动力和内脏敏感性(visceralsensitivity)。血清素(5-羟色胺[5-HT])是肠功能的关键调节剂，已知其在IBS的病理生理学中起着主要作用。5-HT的活性受cGMP调节。尽管IBS和炎性肠病(IBD)的确切原因是未知的，但是胃肠粘膜的持续更新的过程的中断可能促进IBD的疾病病理和IBS加重。胃肠道内衬的更新过程是有效且动态的过程，该过程包括对不需要的受损细胞持续的增殖和补充。胃肠道粘膜内衬细胞的增殖速率非常高，仅次于造血系统。胃肠道体内平衡取决于肠道粘膜内衬上皮细胞的增殖和程序性细胞死亡(细胞凋亡)两者。细胞不断的从绒毛损失进入肠道内腔，并通过在隐窝处以基本上相等的速率通过细胞增殖，随后其向上移动到绒毛而进行补充。肠上皮的细胞增殖和细胞凋亡的速率可在许多环境中(例如响应于生理学刺激诸如衰老、炎性信号、激素、肽、生长因子、化学品和膳食习惯)增加或减小。此外，增加的增殖速率通常与周转时间的减少和增殖区域的扩大相关。增殖指数在病理状态诸如溃疡性结肠炎和其他肠胃病症中高得多。肠增生是胃肠炎症的主要促进因素。细胞凋亡和细胞增殖一起调节细胞数量且确定增殖指数。降低的细胞凋亡速率通常与异常生长、发炎、和赘生转化有关。因此，增殖增加和/或细胞死亡减少可以增加肠道组织的增殖指数，其进而可以导致胃肠道炎性疾病。除了尿鸟苷素和鸟苷肽作为肠液和离子分泌的调节剂的作用外，这些肽还可通过维持增殖与细胞凋亡之间的平衡参与胃肠粘膜的持续更新。例如，尿鸟苷素和鸟苷肽似乎可以通过控制细胞离子流动而促进细胞凋亡。考虑到炎性状况在西方社会的流行率，存在改善炎性状况，特别是胃肠道的炎性状况治疗选择的需要。鸟苷酸环化酶C激动剂的肽激动剂(“GCC激动剂”)描述于美国专利号7,041,786、7,799,897和美国专利申请公开号US2009/0048175、US2010/0069306、US2010/0120694、US2010/0093635、和US2010/0221329。然而，药物应用的肽的固相合成提出了多个具体问题，诸如总产量低(例如，低于10％)。
技术实现思路
本专利技术提供制备肽、尤其是包含鸟苷酸环化酶C(“GCC”)的肽激动剂序列的肽的方法。GCC激动剂序列选自SEQIDNOs:1-249。GCC激动剂序列的长度是n个氨基酸单元，N-端单元在位置1且C-末端单元在位置n。本专利技术的方法包括合适肽片段的固相和/或溶液相合成，随后在溶液中的片段缩合以形成线性粗肽，和任选的线性粗肽的半胱氨酸氨基酸残基的氧化环化以形成环化的最终产物。具体而言，该方法包括以下步骤：提供第一片段，所述第一片段具有GCC激动剂序列的从位置j到位置k的氨基酸单元的第一序列，其中j是1和n-1之间的整数，k是2和n之间的整数且大于j，且所述第一片段除了位置j的氨基酸单元的氨基或者位置k的氨基酸单元的羧基之外受保护，提供第二片段，所述第二片段具有GCC激动剂序列的从位置h到位置j-1的氨基酸单元的第二序列或具有GCC激动剂序列的从位置k+1到位置m的氨基酸单元的第三序列，其中h是1和n-2之间的整数且小于j，m是k+2和n之间的整数，且所述第二片段除了位置j-1的氨基酸单元的羧基或者位置k+1的氨基酸单元的氨基之外受保护，和经由溶液相合成将所述第一片段和所述第二片段偶联以得到具有GCC激动剂序列的从位置h到位置k的氨基酸单元序列的受保护的肽，或具有GCC激动剂序列的从位置j到位置m的氨基酸单元序列的受保护的肽。本专利技术的方法可以包括以下实施方案中所述的一个或多个特征。在一个实施方案中，GCC激动剂序列选自SEQIDNOs:1、8、9、55、56、58、和59。在一个实施方案中，GCC激动剂序列是SEQIDNO：1或9。在一个实施方案中，h是1，j是7，且k是16。更具体地，第一片段具有SEQIDNO:1或9的从位置7到位置16的氨基酸单元序列，且第二片段具有SEQIDNO:1或9的从位置1到位置6的氨基酸单元序列。在另一个实施方案中，h是7，j是15，且k是16。更具体地，第一片段具有SEQIDNO:1或9的从位置15到位置16的氨基酸单元序列，第二片段具有SEQIDNO:1或9的从位置7到位置1本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备包含GCC激动剂序列的肽的方法，所述GCC激动剂序列选自SEQ ID NOs:1‑249，其中所述GCC激动剂序列是

【技术特征摘要】
2011.03.01 US 61/4478911.制备包含GCC激动剂序列的肽的方法，所述GCC激动剂序列选自SEQIDNOs:1-249，其中所述GCC激动剂序列是n个氨基酸单元长度，N-末端单元在位置1且C-末端单元在位置n，所述方法包括：提供第一片段，所述第一片段具有所述GCC激动剂序列的从位置j到位置k的氨基酸单元的第一序列，其中j是1和n-1之间的整数，k是2和n之间的整数且大于j，且所述第一片段除了位置j的氨基酸单元的氨基或者位置k的氨基酸单元的羧基之外受保护，提供第二片段，所述第二片段具有所述GCC激动剂序列的从位置h到位置j-1的氨基酸单元的第二序列或具有所述GCC激动剂序列的从位置k+1到位置m的氨基酸单元的第三序列，其中h是1和n-2之间的整数且小于j，m是k+2和n之间的整数，且所述第二片段除了位置j-1的氨基酸单元的羧基或者位置k+1的氨基酸单元的氨基之外受保护，和经由溶液相合成将所述第一片段和所述第二片段偶联以得到具有所述GCC激动剂序列的从位置h到位置k的氨基酸单元序列的受保护的肽，或具有所述GCC激动剂序列的从位置j到位置m的氨基酸单元序列的受保护的肽。2.权利要求1的方法，其中所述GCC激动剂序列选自SEQIDNOs:1、8、9、55、56、58、和59。3.权利要求1的方法，其中所述GCC激动剂序列选自SEQIDNOs:1和9。4.权利要求3的方法，其中经由固相肽合成提供所述第一片段和第二片段中的至少一个。5.权利要求4的方法，其中所述固相肽合成是Fmoc固相合成。6.权利要求5的方法，其中所述Fmoc固相合成在2-氯三苯甲基树脂上进行。7.权利要求3的方法，其中h是1，j是7，且k是16。8.权利要求3的方法，其中h是7，j是15，且k是16。9.权利要求8的方法，进一步包括将具有所述GCC激动剂序列的从位置7到位置16的氨基酸单元序列的受保护的肽的位置7的氨基酸单元的氨基脱保护，以得到位置-7反应性肽。10.权利要求9的方法，进一步包括提供具有所述GCC激动剂序列的从位置1到位置6的氨基酸单元序列的第三片段，其中所述第三片段除了位置6的氨基酸的羧基之外受保护。11.权利要求10的方法，其中经由固相肽合成提供所述第三片段。12.权利要求11的方法，其中所述固相肽合成是Fmoc固相合成。13.权利要求10的方法，进一步包括经由溶液相合成将所述第三片段和所述位置-7反应性肽偶联，以得到具有所述GCC激动剂序列的从位置1到位置16的氨基酸单元序列的受保护的线性肽。14.权利要求13的方法，进一步包括将受保护的线性肽脱保护，以得到脱保护的线性肽。15.权利要求14的方法，进一步包括氧化所述脱保护的线性肽，以得到包含选自SEQIDNOs:1和9的GCC激动剂序列的肽。16.权利要求1的方法，其中经由固相肽合成提供所述第一片段和第二片段中的至少一个。17.权利要求16的方法，其中所述固相肽合成是Fmoc固相合成。18.权利要求1的方法，其中所述第一片段和第二片段中的每一个不超过10个氨基酸单元长度。19.权利要求18的方法，其中所述第二片段具有所述GCC激动剂序列的位置h到位置j-1的氨基酸单元的第二序列，且所述第二片段的位置j-1的氨基酸单元和所述第一片段的位置k的氨基酸单元中的任一个或两个选自甘氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸和精氨酸。20.权利要求18的方法，其中所述第二片段具有所述GCC激动剂序列的位置h到位置j-1的氨基酸单元的第二序列，且所述第二片段的位置j-1的氨基酸单元和所述第一片段的位置k的氨基酸单元中的任一个或两个选自甘氨酸和脯氨酸。21.权利要求18的方法，其中所述第二片段具有所述GCC激动剂序列的位置k+1到位置m的氨基酸单元的第三序列，且所述第二片段的位置m的氨基酸单元和所述第一片段的位置k的氨基酸单元中的任一个或两个选自甘氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸和精氨酸。22.权利要求18的方法，其中所述第二片段具有所述GCC激动剂序列的位置k+1到位置m的氨基酸单元的第三序列，且所述第二片段的位置m的氨基酸单元和所述第一片段的位置...

【专利技术属性】
技术研发人员：J拜，R张，J贾，J周，Q赵，G张，K沙伊鲁布海，S科米斯凯，R冯，
申请(专利权)人：辛纳吉制药公司，
类型：发明
国别省市：美国,US