人可溶性鸟苷酸环化酶的高效制备方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及一种人可溶性鸟苷酸环化酶（ｓＧＣ）的高效制备方法。本发明专利技术方法通过如下步骤：（１）将人可溶性鸟苷酸环化酶核苷酸编码序列装入表达载体，并转化表达用大肠杆菌菌株；（２）将（１）所得菌株接种于改进后的ＴＢ培养液，ＩＰＴＧ诱导表达过夜；（３）将（２）所得菌体破菌，离心，过Ｎｉ－ＮＴＡ柱，ｔｅｖ酶酶切，过Ｎｉ－ＮＴＡ柱，ｈｅｍｅ重组。制得纯度达９０％以上的人可溶性鸟苷酸环化酶蛋白，产量达２０ｍｇ／Ｌ以上，本方法能克服目前人可溶性鸟苷酸环化酶产量较低，成本较高，不能满足对ｓＧＣ的应用需求的缺陷，是目前产量最高的低成本表达方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程和蛋白表达领域，涉及一种用生物工程高效制备人的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的方法。
技术介绍
生命体中内源性化学小分子N0、C0、H2S、H202等作为细胞信号转导分子在心血管系统和神经系统中有非常重要的生理功能。基于这些化学小分子的信号转导分子机制及其与疾病诊断治疗和创新药物开发研究是近几年来化学生物学和生物医学领域研究的一个前沿热点。可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)作为信使分子NO的受体，是由a和|3两个亚基组成的含有血红素的异源二聚体。当NO与sGC的heme结合后可以激活sGC催化GTP转化为二级信使分子cGMP，进而介导一系列的生物级联反应。 对于NO如何激活sGC提出了较多的模型，但是其确切机理仍然不清楚，原因主要是由于不能得到足量的高纯度的sGC蛋白，另一方面sGC全蛋白比较大(a约80kDa和P约70kDa)，从而阻止了人们对于其结构_功能_性质_反应的深入研究。 目前sGC蛋白的获得途径主要有两种一是从组织当中提取，但是这种方法提取得到的量很少( 2mg/kg牛肺)，对于人的sGC蛋白来说更是由于组织来源的限制而变得几乎不可能。第二种途径是从真核细胞中表达这种方法蛋白产率低( 130ii g/25ml细胞提取液)，成本相当高。虽然有细菌体的sGC血红素结构域在大肠杆菌中表达的报道，但是它们与真核生物的血红素结构域同源性很低。对于真核生物的sGC蛋白，只有Marietta等人在大肠杆菌中表达了小鼠的13 1亚基的血红素结构域和催化结构域，但是他们所得到的可溶性蛋白的产量相当低。到目前为止还没有人的sGC蛋白在大肠杆菌中表达的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种操作简单，成本低，产率高，纯度高的人的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的制备方法。 本专利技术提供了一种，该方法包括以下步骤 (1)将人可溶性鸟苷酸环化酶核苷酸编码序列装入表达载体，并转化表达用大肠杆菌菌株； (2)将(1)所得菌株接种于改进后的TB培养液，IPTG诱导表达过夜； (3)将(2)所得菌体破菌，离心，过Ni-NTA柱，tev酶酶切，过Ni-NTA柱，heme重组即可。本专利技术的方法中，(1)中所述表达载体可以是pMAL-c2x、pET28b或者pET22b。本专利技术的方法中，所述表达载体可以为MBraT-mCherry2质粒。 本专利技术的方法中，(1)中所述大肠杆菌菌株可以是BL21 (DE3)pLysS、Rosetta(DE3)pLysS或者Rosetta(DE3)。 本专利技术的方法中，(3)中破菌方法可以是超声、反复冻融或者溶菌酶酶解。 本专利技术的方法中，"人可溶性鸟苷酸环化酶核苷酸编码序列"是指编码具有人可溶性鸟苷酸环化酶的核苷酸序列(GENBANK登陆号NM_000857)，如序列中开放阅读框位置核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于NM_000857序列的编码框开放阅读框位置核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与NM_000857序列的编码框开放阅读框位置核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出NM_000857所述的序列。 在本专利技术中，术语"人可溶性鸟苷酸环化酶核苷酸编码序列"指具有人可溶性鸟苷酸环化酶活性的如上述序列对应的多肽。该术语还包括具有与上述蛋白具有相同功能的变异形式。这些变异形式包括若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人可溶性鸟苷酸环化酶的活性片段和活性衍生物。 该多肽的变异形式还包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、人可溶性鸟苷酸环化酶核苷酸的融合蛋白、以及利用抗人可溶性鸟苷酸环化酶核苷酸血清获得的多肽或蛋白。 本专利技术的方法中采用的表达载体和菌株可以采用该领域常用的表达载体和宿主菌，例如MBPHT-mCherry2载体和大肠杆菌Rosetta (DE3) pLysS， pMAL-c2x和BL21 (DE3)pLysS， pET28b禾口 Rosetta(DE3)pLysS， pET22b禾口 Rosetta(DE3)。 把人可溶性鸟苷酸环化酶编码序列装入载体并转化菌株可以采用常规的方法。例如，先将人可溶性鸟苷酸环化酶编码序列装入pBluescriptR等载体中扩增，然后再构建表达载体；再如，在人可溶性鸟苷酸环化酶编码序列5 '和3'加入载体上已有的酶切位点，从而将编码序列插入载体的多克隆位点处。转化采用热激转化。 改进后的TB培养基包括5-10g/L蛋白胨，5-10g/L酵母提取物，2_10ml/L甘油，O. 01-0. 02mol/L KH2P04，0. 1-0. 2mol/L K2HP04， l_2g/L MgS04， l_4g/LNaN03， 10_30mMGlucose (葡萄糖)。 IPTG诱导可以采用市售的IPTG和常规的诱导条件。诱导过夜是指诱导时间在10-16小时。 本专利技术的方法中，步骤(3)主要是分离纯化蛋白。可以采用常规方法分离纯化，本专利技术还采用效果较好的Ni-NTA柱等技术分离纯化。由于表达的融合蛋白是带有麦芽糖融合蛋白(MBP)标签和组氨酸(His)标签的，本专利技术用Ni-NTA柱来纯化，Ni-NTA柱是组氨酸(His)标签的亲和柱，其亲和性和特异性都比较高，所以纯化效果比较好。而Amylose(淀粉多糖)柱是麦芽糖融合蛋白(MBP)标签的亲和柱，可以用它来纯化蛋白，但是它的亲和力相对比较差，柱效比较低。本专利技术所用的tev酶是特异识别ENLYFQG肽段的一种酶，在构建质粒时我们把这个七肽序列加在了MBP和目的蛋白序列之间，所以可以用tev酶来酶切。可以用Factor-Xa来切割，但是比较贵。 本专利技术中，使用了 heme重组。这是因为sGC是一种血红素蛋白，血红素蛋白是指由4血红素(heme)辅基和脱辅基蛋白(即o-protein)组成的一大类蛋白。 一般血红素辅基是其活性中心。sGC在人体内是以heme结合的形式存在的，但是由于我们是将质粒在大肠杆菌中表达，所以经常会出现只表达脱辅基蛋白，而heme不能在大肠杆菌中重组上去，另外，在蛋白纯化过程中也容易出现heme从蛋白的血红素腔中脱离出来，变成脱辅基蛋白。所以需要在得到纯的即o-protein后再将heme重组至血红素腔内。 本专利技术的一个实施例中，采用下述方法具体制备了人sGC。首先，将人sGC-P 1基因(可以从复能基因公司购得，可从genbank搜索到)。克隆至MBraT-mCherry2载体，并抽提得到含有目的基因的表达质粒。然后，将质粒转化到表达用基因工程菌，接种于改进的TB (含50 g/mL氨苄青霉素)培养液，37"培养至0D6。。 0. 6后加IPTG并降温至20°C诱导表达 12h后收菌。上述菌体超声破菌离心，过Ni-NTA柱，tev酶酶切，本文档来自技高网...

【技术保护点】
人可溶性鸟苷酸环化酶的高效制备方法，其特征是，该方法包括以下步骤：　　（１）将人可溶性鸟苷酸环化酶核苷酸编码序列装入表达载体，并转化表达用大肠杆菌菌株；　　（２）将（１）所得菌株接种于改进后的ＴＢ培养液，ＩＰＴＧ诱导表达过夜；　　（３）将（２）所得菌体破菌，离心，过Ｎｉ－ＮＴＡ柱，ｔｅｖ酶酶切，过Ｎｉ－ＮＴＡ柱，ｈｅｍｅ重组即可。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谭相石，钟方芳，王红艳，黄仲贤，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]