猪三种致腹泻病毒中和抗原表位融合蛋白及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及猪三种致腹泻病毒中和抗原表位融合蛋白重构体及其制备方法和应用。所述猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV的中和抗原表位融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码该中和抗原表位融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术分别选取PEDV、TGEV、PoRV的主要中和抗原表位基因并进行拼接，而后通过重组杆状病毒真核表达系统对串联基因进行融合蛋白表达。将表达串联基因融合蛋白的重组病毒通过腹腔注射的方式免疫小鼠，可诱导机体产生免疫应答，具有较强的免疫原性。本发明专利技术为预防PEDV、TGEV、PoRV感染提供了一种新的方法，也为猪腹泻病毒新型疫苗的开发奠定了基础。

Construction and application of fusion proteins of Neutralizing Antigen Epitopes of three diarrhea causing viruses

【技术实现步骤摘要】
猪三种致腹泻病毒中和抗原表位融合蛋白及其构建方法和应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及猪三种致腹泻病毒中和抗原表位融合蛋白及其构建方法和应用。
技术介绍
由猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)引起的猪腹泻是严重危害养猪业的急性、高度传染性的肠道疾病。猪腹泻发病特点是严重的肠炎、呕吐和水性腹泻，特别是哺乳仔猪死亡率高，能够造成重大经济损失，成为养猪行业的一个重要问题。尽管近年来针对其研制了相应疫苗，但效果不是十分理想，而且随着病毒的遗传变异，疫苗保护效力愈发不稳，所以很长一段时间内，猪腹泻类病毒感染仍然是中国养猪业的一个不容忽视的问题。而相关疫苗的发展也是困难重重，例如早期，研究者在体外细胞上获得PEDV是十分困难的，大多数病毒分离自小肠原代细胞感染仔猪的粪便和肠内容物后得到的。直到1988年Hofmann和WyLer才第一次有报道称PEDV能够连续在Vero细胞上进行传代培养。病毒难分离，难以传代培养，传代病毒含量低等因素的存在，使得传统疫苗的研发带来诸多挑战。而且根本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV的中和抗原表位融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV的中和抗原表位融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.一种编码权利要求1所述的猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白的基因，其特征在于：序列如SEQIDNO.1所示。


3.一种猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV的中和抗原表位融合蛋白的重组杆状病毒表达载体，其特征在于，含有序列如SEQIDNO.1所示中和抗原表位融合蛋白的基因抗原表位融合蛋白的基因。


4.权利要求1所述的猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
1)获得含有PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白重组基因片段：
利用PCR方法设计3对引物如下：
PEDV-COE-F：5'-CGGGATCCTTCTAGAAACCTTCTGAGTC-3'，
PEDV-COE-R：5'-CGGAATTCATACTTGGTACACACAT-3'，
TGEV-S-F：5'-CGGAATTCGGTTCTGGATCAGGAGGTTCTGGATCAGGATACACACATACCATT-3'，
TGEV-S-R：5'-CCGCTCGAGTATAACAGCTGTGGCATCT-3'，
PoRV-VP7-F：
5'-CCGCTCGAGGGTTCTGGATCAGGAGGTTCTGGATCAGGACCAAATGAAGCAGCTACAG-3'，
PoRV-VP7-R：5'-GGGGTACCGCAGCAGAATCTAAGG-3'；
并利用RT-CR反应扩增分别得到PEDV-COE、TGEV-SA、PoRV-VP7的基因片段；反应体系为：GreenTaqMix12.5μL，cDNA2μL，RnaseFreedH2O9.5μL，上下游引物各1μL；PCR反应程序：95℃5min，95℃1min，61℃1min，72℃1min，共30个循环；72℃10min；...

【专利技术属性】
技术研发人员：金文杰，宁晨，秦爱建，邵红霞，钱琨，黄晓星，王加圆，王倩倩，郑建高，王建，王姣，邓建中，王秋生，洪枫，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32