一种高效表达PCV2 Cap、PCV3 Cap融合蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了一种高效表达PCV2 Cap、PCV3 Cap融合蛋白的方法，首先构建了一株高效表达PCV2Cap蛋白和PCV3Cap蛋白的重组杆状病毒：将截去核定位信号的PCV2Cap蛋白的核苷酸序列与PCV3Cap蛋白的核苷酸序连接，中间用一段疏水的柔性蛋白linker序列连接，在PCV2Cap蛋白和PCV3Cap蛋白序列的N端加入蜂素信号肽序列，促使其分泌表达。重组阳性杆状病毒感染sf9昆虫细胞表达的蛋白进行了多种翻译后修饰，接近于天然的病毒编码蛋白，具有较高的生物学活性，而且杆状病毒具有高度的种属特异性，仅感染昆虫细胞，对脊椎动物细胞无感染性，其表达产物安全可靠，经简单处理即可用于后续试验。因此，本发明专利技术的方法表达PCV2 Cap和PCV3 Cap融合蛋白，比传统方式更加安全有效。

A method of high expression of PCV2 cap and pcv3 cap fusion protein

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白的方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种高效表达PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白的方法。
技术介绍
猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV）主要侵害断奶仔猪和育肥猪，可以引起多种猪圆环病毒相关性疾病，养猪业的健康发展带来巨大威胁。按照抗原性、致病性以及基因同源性的不同，将PCV划分成猪圆环病毒1型（Porcinecircovirus1，PCV1）、猪圆环病毒2型（Porcinecircovirus2，PCV2）以及猪圆环病毒3型（Porcinecircovirus2,PCV2）三种基因型。已知PCV1无致病性，而PCV2有较强的致病性，可引起多种猪圆环病毒相关性疾病（Porcinecircovirus-associateddiseases,PCVADs），其中最主要的是断奶仔猪多系统衰弱综合征（Postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS），该病在我国乃至世界猪群中广泛存在，已成为一种常见病和多发病，且多与其它病原发生混合感染，给养猪业带来了巨大损失。PCV3感染可引起猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。患病母猪受孕率降低，流产率增加，生下不同胎龄的死胎、木乃伊胎；患病仔猪出现多器官系统的功能紊乱，严重影响全世界的生猪养殖业的发展。PCV2与PCV3Cap蛋白氨基酸同源性仅为30%，两者间存在交叉免疫保护可能性较低，目前，仍没有可同时预防和控制PCV2与PCV3的疫苗和药物。因此研发一种安全有效的预防PCV2与PCV3的疫苗对预防和控制PCV的感染具有重要的意义。目前，利用大肠杆菌优化密码子表达融合蛋白的方法较为常见。因具有培养条件简单经济、生长繁殖快速、基因改造工具及宿主种类多样等显著优势，一直作为外源蛋白表达的首选系统。但在很多实际应用过程中，其融合蛋白生产效率及产品质量随具体体系不同存在较大差异。有些体系中的蛋白表达效率低下，产物浓度低，收集和纯化困难，难以满足实际生产和应用需要；有些体系中外源蛋白虽然能高水平表达，但却形成大量无活性的包涵体，具有生物活性的可溶性蛋白有限，甚至完全检测不到活性表达，造成物质和能量的浪费。蛋白质的后续加工涉及到对无活性的包涵体蛋白进行体外复性、纯化等，但蛋白体外复性一方面增加了实际生产过程的复杂程度，另一方面其生产成本高、产量低，无法广泛地推广应用。采用CHO细胞所生产PCV2Cap-PCV3Cap融合蛋白表达量高，但是也存在很多弊端。由于目前利用CHO细胞生产目的蛋白的技术水平尚不能满足生物药品的开发以及生产需求，在其上游生产中还存在诸多问题，例如：①某些糖基化表达产物不稳定、不易纯化；②重组CHO细胞上游构建与下游纯化脱节，主要表现在上游构建主要考虑其高效表达而对产物能否有效的提取出来即分离纯化考虑较少；③重组细胞培养费用昂贵。自动化水平低。目前采用CHO细胞生产PCV2Cap-PCV3Cap融合蛋白其表达量为0.8mg/mL，该产量是经过放大培养并优化培养条件、补料时间和补料量并经过亲和层析、生理盐水透析之后的最大产量，应用于疫苗生产中时仍存在表达量低、生产、纯化过程复杂等问题。虽然国内已有利用重组杆状病毒进行PCV2ORF2基因的表达，表达量均在0.1-0.4mg/mL左右，重组蛋白表达量比较低成为进一步开发利用的障碍。
技术实现思路
针对目前PCV2Cap-PCV3Cap融合蛋白表达量低、纯化过程复杂等问题，本专利技术提供一种新的表达PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白的方法，病毒纯化和鉴定步骤简单，蛋白经过多种翻译后修饰，接近于天然的病毒编码蛋白，具有较高的生物学活性。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白，包括截短PCV2Cap蛋白段、接头序列（Linker）、PCV3Cap蛋白段和蜂素信号肽区域。所述截短PCV2Cap蛋白段为去除核定位信号的PCV2Cap蛋白。所述接头序列优选为疏水柔性肽链。所述接头序列如SEQIDNO:1所示。一种上述融合蛋白的核酸序列。优选的，所述核酸序列包括如SEQIDNO:2所示的序列。所述核酸序列还可以包括限制性内切酶的酶切位点。一种包含上述核酸序列的载体、重组杆粒和重组杆状病毒。优选的，所述核酸序列在载体、重组杆粒或重组杆状病毒中为双拷贝。优选的，所述载体为pFastBacTM质粒；更优选为pFastBacTMDual质粒。一种上述载体、重组杆粒或重组杆状病毒用于表达PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白。所述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：通过含上述核酸序列的载体转染含杆粒骨架的感受态细胞获得重组杆粒；重组杆粒转染昆虫宿主细胞，获得含重组杆状病毒的上清液；含重组杆状病毒的上清液接种昆虫宿主细胞，培养后获得上清液；上清液分离纯化后获得PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白。所述昆虫宿主细胞选自Sf9细胞，Sf21细胞，Hi-5细胞或S2细胞。所述接种的接种量为MOI为0.1-1.0，昆虫宿主细胞的密度为2.5×106个/mL，培养时间为接种后1-5天。所述分离纯化可以选择常规的蛋白纯化方法，如离心、透析、超滤、亲和柱层析等，以去除细胞或细胞残体、杂蛋白、培养基成分等杂质。具体的，包括以下步骤：（1）将含有如SEQIDNO:2所示的序列插入pFastBacTMDual质粒的两个启动子之后，获得重组质粒pFD-H-2Cap-3Cap；（2）将重组质粒pFD-H-2Cap-3Cap转化进DH10Bac大肠杆菌感受态，筛选并提取获得重组杆粒rBacmid-H-2Cap-3Cap；（3）将重组杆粒rBacmid-H-2Cap-3Cap转染昆虫宿主细胞，培养获得含重组杆状病毒rpFB-H-2Cap-3Cap的上清液；（4）将步骤（3）的上清液接种昆虫宿主细胞培养后获得含有PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白的上清液，分离纯化后获得PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白。一种上述融合蛋白在制备猪圆环病毒疫苗、抗体、抗原、检测试剂盒中的应用。一种含有上述融合蛋白的猪圆环病毒疫苗。本专利技术具有以下优点：本专利技术构建了一株高效表达PCV2Cap蛋白和PCV3Cap蛋白的重组杆状病毒。昆虫杆状病毒表达系统不但能够加快外源蛋白表达速度，既使外源蛋白具有较高的表达效率，又使其尽可能地以活性可溶形式存在，缩短了后期纯化蛋白的时间，降低了生产成本，使融合蛋白达最佳表达效果。而且昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白，对于开发PCV2与PCV3Cap蛋白疫苗具有重要的经济和社会价值。本专利技术的重组杆状病毒将截去核定位信号的PCV2Cap蛋白的核苷酸序列与PCV3Cap蛋白的核苷酸序连接，中间用一段疏水的柔性蛋白linker序列连接，在PCV2Cap蛋白和PCV3Cap蛋白序列的N本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PCV2 Cap、PCV3 Cap融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括截短PCV2 Cap蛋白段、接头序列、PCV3 Cap蛋白段和蜂素信号肽区域；所述截短PCV2 Cap蛋白段为去除核定位信号的PCV2 Cap蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括截短PCV2Cap蛋白段、接头序列、PCV3Cap蛋白段和蜂素信号肽区域；所述截短PCV2Cap蛋白段为去除核定位信号的PCV2Cap蛋白。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述接头序列为疏水柔性肽链；优选的，所述接头序列如SEQIDNO:1所示。


3.一种如权利要求1或2所述的融合蛋白的核酸序列。


4.根据权利要求3所述的核酸序列，其特征在于，包括如SEQIDNO:2所示的序列。


5.一种如权利要求3或4所述的核酸序列的载体、重组杆粒和重组杆状病毒，其特征在于，所述核酸序列在载体、重组杆粒或重组杆状病毒中为双拷贝；
优选的，所述载体为pFastBacTM质粒；更优选为pFastBacTMDual质粒。


6.一种如权利要求5所述的载体、重组杆粒或重组杆状病毒在表达PCV2Cap、PCV3C...

【专利技术属性】
技术研发人员：李俊，王硕，吴晓燕，时建立，彭喆，李琛，徐绍建，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37