基于TGF-β改造的嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞制造技术

本发明专利技术提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括dnTGF‑βRII结构域和IL‑2Rβ结构域，dnTGF‑βRII结构域和IL‑2Rβ结构域通过CD8跨膜结构域相连；所述dnTGF‑βRII结构域与TGF‑βII型受体的胞外段序列同源性在90％以上，且能特异性识别TGF‑β的蛋白结构域；所述IL‑2Rβ结构域是序列与IL‑2受体β链序列同源性在90％以上的蛋白结构域。本发明专利技术还提供了一种包括前述嵌合抗原受体的CAR‑T细胞。本发明专利技术可以增强CAR‑T细胞在实体瘤中的扩增能力，有利于CAR‑T技术在实体瘤治疗中的应用推广。

TGF - \u03b2 modified chimeric antigen receptor and its modified immune cells

【技术实现步骤摘要】
基于TGF-β改造的嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞
本专利技术属于癌症的免疫治疗药物领域，尤其涉及一种基于TGF-β改造的嵌合抗原受体。
技术介绍
正常情况下，免疫系统可以识别并清除肿瘤微环境中的肿瘤细胞，但为了生存和生长，肿瘤细胞能够采用不同策略，使人体的免疫应答受到抑制而不能正常的杀伤肿瘤细胞，从而在抗肿瘤免疫应答的各阶段得以幸存。肿瘤免疫治疗就是通过恢复机体正常的抗肿瘤免疫应答，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。肿瘤免疫疗法包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗等。近几年，肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创新性，在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破，其中CAR-T(ChimericantigenreceptorTcells，嵌合抗原受体修饰的T细胞)治疗与CTLA-4、PD-1/PD-L1抗体治疗被认为肿瘤免疫治疗三大进展。CAR-T疗法就是利用抗原抗体scFv片段，联合细胞内激活、增殖信号相关蛋白结构域，构建得到嵌合抗原受体，将其表达于T细胞，可使T细胞直接获得抗体的特异识别能力、成为不依赖HLA(人类白细胞抗原)限制的效应T细胞。经过设计的CAR-T细胞可在实验室培养生长，达到数十亿之多，再将扩增后的CAR-T细胞注入到患者体内，注入之后的T细胞也会在患者体内增殖，并杀死具有相应特异性抗原的肿瘤细胞，长期存活并形成免疫记忆。因其在难治性血液肿瘤中取得的突破性进展，疗效突出，2017年美国FDA接连批准Kymriah和Yescarta两种CAR-CD19疗法用于临床治疗。也有研究将嵌合抗原受体表达于T细胞以外的免疫细胞，诸如单核细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞等，使这些免疫细胞也获得特异识别肿瘤细胞，发挥免疫治疗的功能。遗憾的是，嵌合抗原受体以及表达嵌合抗原受体的免疫细胞至今在实体瘤临床应用进展缓慢，仅取得有限的治疗应答。主要原因之一为：肿瘤微环境中存在大量的抑制免疫细胞的细胞因子，这些细胞因子使得表达嵌合抗原受体的免疫细胞无法达到并维持一个较高的数量水平。转化生长因子β(TGF-β)在众多抑制免疫细胞的细胞因子中，对T细胞的抑制作用最为明显。TGF-β在卵巢癌、肺癌、结直肠癌等大多数实体瘤都有高水平表达，不仅直接影响效应T细胞功能，还能抑制其扩增并诱导向抑制性T细胞分化。TGF-β还能抑制自然杀伤细胞、单核细胞和中性粒细胞的细胞毒性。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是，提供一种能帮助免疫细胞抵抗TGF-β抑制作用的新的嵌合抗原受体，及其修饰的免疫细胞。本专利技术的技术方案包括：一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括dnTGF-βRII结构域和IL-2Rβ结构域，dnTGF-βRII结构域和IL-2Rβ结构域通过跨膜结构域相连；所述dnTGF-βRII结构域是与TGF-βII型受体的胞外段序列同源性在90％以上，且能特异性识别TGF-β的蛋白结构域；所述IL-2Rβ结构域是序列与IL-2受体β链序列同源性在90％以上的蛋白结构域。如前述的嵌合抗原受体，所述dnTGF-βRII结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示；和/或，所述IL-2RB结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.12所示。如前述的嵌合抗原受体，所述跨膜结构域是与CD28、CD8、CD3ζ、CD134、CD137、ICOS、DAP10或CD27蛋白跨膜区序列同源性90％以上的蛋白结构域；优选地，所述跨膜结构域是与CD8蛋白跨膜区序列同源性90％以上的蛋白结构域；更优选地，所述跨膜结构域是CD8蛋白的跨膜结构域。如前述的嵌合抗原受体，所述跨膜结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.14所示。下文中，前述的嵌合抗原受体，也称为“本专利技术嵌合抗原受体”。一种重组质粒，它包括能表达本专利技术嵌合抗原受体的DNA片段；优选地，所述本专利技术嵌合抗原受体的DNA片段的序列如SEQIDNO.8所示。如前述的重组质粒，它还包括表达传统嵌合抗原受体的DNA片段；所述传统嵌合抗原受体是能靶向识别肿瘤细胞表面蛋白的嵌合抗原受体；优选地，所述表达传统嵌合抗原受体的DNA与表达本专利技术嵌合抗原受体的DNA之间通过表达自剪切2A肽段的DNA连接；进一步优选地，所述表达自剪切2A肽段的DNA序列如SEQIDNO.7所示。一种重组病毒，所述重组病毒能表达本专利技术嵌合抗原受体；优选地，所述病毒携带前述重组质粒。一种嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，所述免疫细胞含有本专利技术嵌合抗原受体，dnTGF-βRII结构域位于细胞膜外侧，IL-2Rβ结构域位于细胞膜内侧；它还含有至少一种特异性靶向肿瘤表面抗原的嵌合抗原受体；优选地，所述特异性靶向肿瘤表面抗原的嵌合抗原受体的胞外段可靶向CD19、CD20、MUC1、EGFR、EGFRvIII、HER2、ERBB3、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、ROR1、CD44等抗原中的至少一种。如前述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，所述免疫细胞为T细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocyte，TIL)；优选地，为T细胞。前述的嵌合抗原受体、重组质粒、重组病毒或嵌合抗原受体修饰的免疫细胞在制备预防或治疗恶性肿瘤的药物中的用途，优选地，所述恶性肿瘤为实体瘤，尤其可以为肺癌、肝细胞癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、胰腺癌或前列腺癌中的至少一种。本专利技术中，术语“结构域”是指蛋白质中空间上可明显区分，又具有各自功能的区段；结构域中部分氨基酸残基的改变(替换、缺失和/或增加)并不会明显引起结构域功能的变化。因此应当知晓：本专利技术涉及的抗原受体，即使发生氨基酸残基改变，只要涉及的结构域功能无明显变化，均在本专利技术的范围内。本专利技术的工作原理可能为：本专利技术嵌合抗原受体的dnTGF-βRII结构域，通过形成二聚体识别细胞外的TGF-β；与dnTGF-βRII结构域相连的IL-2Rβ结构域距离被拉近，也形成二聚体。IL-2Rβ形成二聚体后，可激活JAK-STAT信号通路，促进本专利技术嵌合抗原受体的宿主细胞(比如T细胞)的增殖。因此，原本抑制宿主细胞的TGF-β作用于本专利技术嵌合抗原受体后，会产生激活作用。即是说，本专利技术的嵌合抗原受体将TGF-β的抑制信号转化成了激活信号。实验证明，将双嵌合抗原受体(本专利技术的嵌合抗原受体与传统嵌合抗原受体)共同表达于T细胞内，可以使T细胞在TGF-β高浓度的各种实体瘤中达到更大的数量，理论上可以显著增加T细胞对实体瘤的疗效，推进CAR-T疗法在实体瘤中的应用，具有十分良好的应用价值。本专利技术的嵌合抗原受体依赖外源的TGF-β发挥激活T细胞的功能，但另有实验表明，即使没有TGF-β存在，同时表达双嵌合抗原受体的T细胞，相比仅表达传统嵌合抗原受体的T细胞，活性更高。虽然本专利技术说明书中只提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括dnTGF-βRII结构域和IL-2Rβ结构域，dnTGF-βRII结构域和IL-2Rβ结构域通过跨膜结构域相连；/n所述dnTGF-βRII结构域是与TGF-βII型受体的胞外段序列同源性在90％以上，且能特异性识别TGF-β的蛋白结构域；/n所述IL-2Rβ结构域是序列与IL-2受体β链序列同源性在90％以上的蛋白结构域。/n

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括dnTGF-βRII结构域和IL-2Rβ结构域，dnTGF-βRII结构域和IL-2Rβ结构域通过跨膜结构域相连；
所述dnTGF-βRII结构域是与TGF-βII型受体的胞外段序列同源性在90％以上，且能特异性识别TGF-β的蛋白结构域；
所述IL-2Rβ结构域是序列与IL-2受体β链序列同源性在90％以上的蛋白结构域。


2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述dnTGF-βRII结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示；
和/或，所述IL-2Rβ结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.12所示。


3.如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述跨膜结构域是与CD28、CD8、CD3ζ、CD134、CD137、ICOS、DAP10或CD27蛋白跨膜区序列同源性90％以上的蛋白结构域；
优选地，所述跨膜结构域是与CD8蛋白跨膜区序列同源性90％以上的蛋白结构域；
更优选地，所述跨膜结构域是CD8蛋白的跨膜结构域。


4.如权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.14所示。


5.一种重组质粒，其特征在于：它包括能表达权利要求1～4任一所述嵌合抗原受体的DNA片段；
优选地，所述嵌合抗原受体的DNA片段的序列如SEQIDNO.8所示。


6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于：它还包括表达传统嵌合抗原受体的DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永生，李丹，陈玥，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，成都华西精准医学产业技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51