A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了A型FMDV 1D蛋白‑铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法。本发明专利技术将含有A型FMDV优势表位与铁蛋白片段的核苷酸序列串联，设计并合成了A型FMDV 1D蛋白表位‑铁蛋白片段；然后与促溶标签和亲和标签EW29相连，得到EW29/促溶标签/A型FMDV 1D蛋白表位‑铁蛋白片段，诱导、亲和纯化后即得A型FMDV 1D蛋白‑铁蛋白融合蛋白。电镜结果显示，该融合蛋白形成了20～25 nm的蛋白笼纳米颗粒。本发明专利技术为进一步研制安全、有效的A型FMDV 1D蛋白疫苗奠定了基础。

Type a FMDV 1D protein ferritin fusion protein, protein cage nanoparticles and their preparation methods

【技术实现步骤摘要】
A型FMDV1D蛋白-铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及A型FMDV1D蛋白-铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法。
技术介绍
通过DNA重组技术，融合蛋白已经很容易在原核表达系统（大肠杆菌）和真核表达系统（酵母和哺乳动物细胞）进行高效表达，其产物在生物和医学上得到了广泛应用，也促进了其快速发展。与真核表达系统相比，大肠杆菌由于易操作、廉价和产量高等优点，仍然是目前生产重组蛋白的主要宿主。但是，当大肠杆菌细菌系统表达重组蛋白时，有许多本身难以克服的缺点：1、重组蛋白往往以无活性的包涵体形式出现；2、缺乏真核细胞翻译后修饰（糖基化、磷酸化和乙酰化等）机制，得到的重组蛋白虽然在一级氨基酸序列正确，但在高级结构和构象上与天然蛋白相差较大，无活性或活性极差；3、宿主细胞（大肠杆菌）自身蛋白成为热原，难以除去，存在安全性，这些问题限制了原核表达的重组蛋白在实际中的进一步应用。鉴于此，选择更有效的亲和促溶性标签以期获得纯度高、可溶性好，活性强的重组蛋白至关重要。来自蚯蚓（Lumbricusterrestris）半乳糖结合凝集素EW29C-末端的半乳糖结合结构域，其分子量为14.5kDa，可以和亲和层析的常用介质琼脂糖的半乳糖残基可逆结合，是一个高效的亲和标签。同时，EW29蛋白本身有很好的可溶性，和其它外源蛋白融合表达时，可以促进外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性（YabeR,SuzukiR,KunoA,FujimotoZ,JigamiYandHirabayashiJ(2007)Tailoringanovelsialicacidbindinglectinfromaricin-Bchain-likegalactosebindingproteinbynaturalevolution-mimicry.JBiochem141,389–399.）。铁蛋白(Ferritin)几乎存在于藻类、细菌、高等植物和动物等所有生物体，是生物体生命所必需的。蛋白壳是由24个亚基以高度对称性方式组成的内空心结构，空心直径约为8nm，外直径约为12nm。研究发现铁蛋白在体外可以自组装，形成套袖样的蛋白笼纳米颗粒；同时，铁蛋白纳米笼可以将外源小分子蛋白装入其纳米笼内，从而有效降低小分子抗原的降解，提高抗原的有效浓度，还可以有效协助靶细胞对相应抗原的摄取、加工，显著增强抗原蛋白的抗原稳定性和免疫原性。因此，铁蛋白独特的结构及理化性质使其可以作为一种新型的抗原递呈纳米运送平台。口蹄疫(Foot-and-mouthdisease，FMD)是由FMD疫病毒(FMDV)引起偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病，FMDV属于微RNA病毒科口蹄疫病毒属成员，病毒基因组为单股正链RNA，全长约为8.5kb，四种结构蛋白VP4（1A）、VP2（1B）、VP3（1B）和VP1（1D）与FMDVRNA组装成为成熟的病毒粒子。FMDV根据血清型特点的不同，可以分为A型、O型、C型、南非I型、南非II型、南非III型和亚洲I型七个血清型。研究表明，各型FMDV的VP1（1D）参与组成病毒的主要中和抗原位点，尤其是VP1的140～160和200～213氨基酸残基。亚单位疫苗因其操作简单，价格低廉，可区分病毒感染与疫苗免疫，在动物疫苗的研发和应用越来越受到重视。通过表达高免疫原性的口蹄疫结构蛋白作为疫苗也引起学者的注意。很多表达系统已经被用于表达FMDV1D蛋白，但大都存在可溶性差，免疫原性弱、外壳蛋白组装效率不高以及成本高等缺点，导致口蹄疫疫苗仍以灭活苗为主。为了解决可溶性差和抗原免疫原性弱等难题，有研究者也尝试换用表达系统，通过酵母或杆状病毒表达系统表达可溶性好，免疫原性强的口蹄疫亚单位疫苗，也有学者通过将口蹄疫结构蛋白上的优势中和表位串联表达，或者嵌合到适宜蛋白的外表面，通过增加蛋白分子量、争取折叠以及某些蛋白在体外自组装而将表位展示在病毒颗粒外表面，从而提高抗原的稳定性和免疫原性（梁特,杨德成,刘蒙蒙,etal.O型口蹄疫病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达[J].中国预防兽医学报,2013,35(3):185-8.徐义兵.FMDVP1-2A、3C蛋白在毕赤酵母中的共表达及免疫原性研究[D];华南农业大学,2012.）。但目前均没有获得既能提高融合蛋白的可溶性又能提高抗原免疫原性的良好方案。
技术实现思路
本专利技术利用半乳糖结合凝集素EW29作为亲和标签，并在促溶标签的作用下，高效可溶性表达和纯化A型FMDV1D蛋白-铁蛋白融合蛋白，该融合蛋白经过自组装可形成蛋白笼纳米颗粒。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术第一方面提供A型FMDV1D蛋白-铁蛋白融合蛋白，包括亲和标签、促溶标签、A型FMDV1D蛋白表位和铁蛋白片段，所述促溶标签位于亲和标签的C端，所述A型FMDV1D蛋白表位位于促溶标签的C端，所述铁蛋白片段位于A型FMDV1D蛋白表位的C端，亲和标签为EW29标签，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，促溶标签的氨基酸序列如SEQIDNO.2～9所示；该A型FMDV1D蛋白-铁蛋白融合蛋白可自组装形成铁蛋白包封A型FMDV1D蛋白的蛋白笼纳米颗粒。优选的，所述A型FMDV1D蛋白表位的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示；所述铁蛋白片段的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示。优选的，表达所述EW29标签的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，表达所述促溶标签的核苷酸序列如SEQIDNO.13～20所示。优选的，表达所述A型FMDV1D蛋白表位的核苷酸序列如SEQIDNO.21所示；表达所述铁蛋白片段的核苷酸序列如SEQIDNO.22所示。本专利技术第二方面提供A型FMDV1D蛋白-铁蛋白融合蛋白自组装形成的蛋白笼纳米颗粒。本专利技术第三方面提供上述蛋白笼纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：步骤1：将A型FMDV1D蛋白的核苷酸序列和铁蛋白片段串联，合成A型FMDV1D蛋白表位-铁蛋白片段；步骤2：将A型FMDV1D蛋白表位-铁蛋白片段与促溶标签相连，得到促溶标签/A型FMDV1D蛋白表位-铁蛋白片段，再将半乳糖结合凝集素EW29作为亲和标签与促溶标签/A型FMDV1D蛋白表位-铁蛋白片段进行串联，形成重组序列，将重组序列连接至表达载体，构建重组载体；步骤3：将重组载体转化到大肠杆菌感受态细胞中，经过诱导表达和亲和层析纯化，得到目的蛋白A型FMDV1D蛋白-铁蛋白融合蛋白；纯化的目的蛋白进行自组装形成蛋白笼纳米颗粒。本专利技术第四方面提供一种重组载体，所述的重组表达载体包含有如上述任一项所述的核苷酸序列。本专利技术第五方面提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含有上述的重组载体。本专利技术第六方面，提供上述的A型FMDV1D蛋白-铁蛋白融合蛋白、上述的A型FMDV1D蛋白-铁蛋白融合蛋白自组装形成的蛋白笼纳米颗粒、上述的蛋白笼纳米颗粒的制备方法在制备FMD1D蛋白疫苗中的应用。现有研究表明，半乳糖结合凝本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白，其特征在于，包括亲和标签、促溶标签、A型FMDV1D蛋白表位和铁蛋白片段，所述促溶标签位于亲和标签的C端，所述A型FMDV 1D蛋白表位位于促溶标签的C端，所述铁蛋白片段位于A型FMDV 1D蛋白表位的C端，亲和标签为EW29标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，促溶标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.2～9所示；该A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白可自组装形成铁蛋白包封A型FMDV 1D蛋白的蛋白笼纳米颗粒。/n

【技术特征摘要】
1.A型FMDV1D蛋白-铁蛋白融合蛋白，其特征在于，包括亲和标签、促溶标签、A型FMDV1D蛋白表位和铁蛋白片段，所述促溶标签位于亲和标签的C端，所述A型FMDV1D蛋白表位位于促溶标签的C端，所述铁蛋白片段位于A型FMDV1D蛋白表位的C端，亲和标签为EW29标签，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，促溶标签的氨基酸序列如SEQIDNO.2～9所示；该A型FMDV1D蛋白-铁蛋白融合蛋白可自组装形成铁蛋白包封A型FMDV1D蛋白的蛋白笼纳米颗粒。


2.根据权利要求1所述的A型FMDV1D蛋白-铁蛋白融合蛋白，其特征在于，所述A型FMDV1D蛋白表位的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示；所述铁蛋白片段的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示。


3.根据权利要求1所述的A型FMDV1D蛋白-铁蛋白融合蛋白，其特征在于，表达所述EW29标签的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，表达所述促溶标签的核苷酸序列如SEQIDNO.13～20所示。


4.根据权利要求2所述的A型FMDV1D蛋白-铁蛋白融合蛋白，其特征在于，表达所述A型FMDV1D蛋白表位的核苷酸序列如SEQIDNO.21所示；表达所述铁蛋白片段的核苷酸序列如SEQIDNO.22所示。


5.权利要求1～4任一项所述的A型FM...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭玉堃，于朋伟，郭豫杰，曾磊，杨国宇，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41