同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及医药生物领域，尤其涉及一种同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体及其制备方法；本发明专利技术公开了一种针对多发性骨髓瘤细胞表面BCMA和CD38双靶点的嵌合抗原受体的构建与应用。本发明专利技术以BCMA抗原和CD38的空间表位为靶点，将BCMA抗体的scfv区，CD38抗体的scfv区，CD8的跨膜区，4‑1BB胞内信号区，CD3zeta胞内信号区，进行串联，构建的嵌合抗原受体用于治疗多发性骨髓瘤，以解决CAR‑T细胞疗法在在治疗多发性骨髓瘤中的高复发问题；有效治疗多发性骨髓瘤瘤，并为多发性骨髓瘤复发/转移的有效防治提供新策略。

Chimeric antigen receptor targeting BCMA and CD38 simultaneously and its application

【技术实现步骤摘要】
同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体及其应用
本专利技术涉及医药生物技术，尤其涉及一种同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体及应用。
技术介绍
多发性骨髓瘤(MM)，是以骨髓中浆细胞异常增殖为特征的恶性“克隆性疾病”，仅有25％的患者接受化疗后生存期在5年以上；在血液学恶性肿瘤中，其发病率仅次于非霍奇金淋巴瘤，是第三大常见血液肿瘤，全世界每年新增病例约114,000例；自1959-2017年，针对多发性骨髓瘤已上市20款药物，主要集中于蛋白酶抑制剂、免疫调节剂，这些新的治疗手段使MM患者的生存率有了很大的提高。然而值得关注的是，大部分的MM患者经过多次治疗后,依旧会出现复发；故更为安全有效的药物，仍为临床急需。BCMA(B-cellmaturationantigen)是B细胞成熟抗原，由185个氨基酸残基组成的III型跨膜蛋白，属TNF受体超家族，其配体属于TNF超家族，如增殖诱导配体(APRIL)B淋巴细胞刺激因子(BAFF)，BCMA与其配体结合后，可激活B细胞的增殖和存活。BCMA特异高表达于浆细胞和多发性骨髓瘤细胞表面，而在造血干细胞和其他正常组织细胞中均不表达，因此，BCMA可以作为MM的靶向性治疗的理想靶点。目前以BCMA为靶点的抗体主要有CA8(专利：US20140105915A1)；C11D5.3、C12A3.2(专利：WO2010104949A2)；J22.9-xi(PDB：4ZFO)；13A4(专利：WO2014122143)，实验数据显示这些抗体与BCMA有很好的结合，并可以很有效地阻断配体与受体的结合，在体外对BCMA高表达的细胞有很强的结合率，以及抑制由BAFF和APIRL诱导引起的增殖抑制作用，同时临床前荷瘤鼠模型中均显示出很好肿瘤细胞清除率，其中以鼠源抗体CA8为基础设计的ADC药物(J6M0-mcMMAF)进入临床治疗阶段。NityaS等设计出了以C11D5.3为基础的，通过化学偶联得到的BCMA、CS1双特异性Fab抗体，发现其对多发性骨髓瘤细胞有更强的抑制作用。CD38分子是单链Ⅱ型跨膜糖蛋白，催化环腺苷二磷酸核糖的合成和降解，参与钙动员，与受体调节的黏附作用密切相关。所有多发性骨髓瘤细胞均高表达，正常情况下在一些非造血组织的淋巴细胞、骨髓细胞相对低表达.Kong等证明了新型鼠抗人CD38单抗daratumumab可通过补体介导细胞毒作用(CDC)或抗体依赖性细胞毒作用在无论骨髓基质细胞是否存在的条件下杀伤CD38+骨髓瘤细胞。另外，结合daratumumab和抗免疫球蛋白G抗体可诱导骨髓瘤细胞凋亡。鼠多发性骨髓瘤模型研究发现，雷利度胺预处理瘤细胞，daratumumab的抗体依赖性细胞毒作用杀伤作用加强.嵌合抗原受体(CAR)是模拟T细胞受体功能的人工受体，其融合了抗原与抗体或配体与受体的识别和结合特异性以及效应T细胞对被识别的肿瘤细胞的杀伤能力。CAR由CD8a引导肽、抗原识别区(配体或单链抗体或Fab片段)、跨膜区、以及T细胞的一系列信号转导区(CD28，CD3，CD137胞内信号传导结构域)依次连接而成。T细胞经修饰后，表面表达的CAR首先通过抗原识别区与肿瘤细胞表面抗原结合，然后通过其信号转导区将活化信号传递至胞内，靶向地激活T细胞对肿瘤细胞杀伤活性。将表达CAR的DNA序列克隆入慢病毒表达载体，并感染从患者血中分离出的T细胞，使T细胞表面表达相应的CAR，再将此修饰的T细胞再输回患者体内，修饰后的T细胞可以在患者体内靶向性地杀伤表达相关抗原的肿瘤细胞，达到清除肿瘤细胞的效果。目前，以BCMA为靶点的CAR-T细胞疗法已开展了多个临床试验，在一项早期临床试验中，35名多发性骨髓瘤患者接受了针对B细胞成熟蛋白(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)T细胞免疫治疗，其中33名(94％)患者出现临床缓解。大多数患者只有轻微的副作用。该研究由Fan等人在2017年ASCO年会(摘要LBA3001)上提出。但是BCMA-CART面临一个高复发率的问题，复发的可能原因是BCMA靶点的丢失。
技术实现思路
专利技术目的：针对上述现有技术存在的技术问题，本专利技术提供了一种同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体及其应用。技术方案：本专利技术所述的一种同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体，包括能同时结合BCMA抗原和CD38抗原的胞膜外抗原结合区、跨膜区和胞内结构域，其中，所述胞膜外抗原结合区包括用于结合BCMA抗原的anti-BCMAscFv和用于结合CD38抗原的anti-CD38scfv；所述anti-BCMAscfv的重链氨基酸序列如SEQNO.1所示，轻链序列如SEQNO.2所示；所述anti-CD38scfv的重链氨基酸序列如SEQNO.3所示，轻链序列如SEQNO.4所示。其中，所述anti-BCMAscfv和anti-CD38scfv采用串联或并联的方式通过Linker链接。进一步的，上述嵌合抗原受体的胞外结构为VH1-VL1-VH2-VL2、VL1-VH1-VH2-VL2、VH1-VL1-VL2-VH2、VL1-VH1-VL2-VH、VH2-VL2-VH1-VL1、VH2-VL2-VL1-VH1、VL2-VH2-VH1-VL1、VL2-VH2-VL1-VH1中的任一种，其中1为anti-BCMAscfv，2为anti-CD38scfv。优选的，所述胞膜外抗原结合区氨基酸序列如SEQNO.5所示。进一步的，上述嵌合抗原受体还包括胞外信号肽结构，信号肽结构为CD8a信号肽，氨基酸序列如SEQNO.6所示；还包括连接胞外区肽段与跨膜区肽段的铰链区CD8a，氨基酸序列如SEQNO.7所示。进一步的，所述跨膜区结构为CD8a，其氨基酸序列如SEQNO.8所示；所述胞内信号结构域或共刺激信号结构域为CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD3。优选的，所述胞内结构域包含SEQNO.10所示的CD3zeta氨基酸序列，胞内共刺激信号结构域包含SEQNO.9所示的4-1BB氨基酸序列。综上，本申请嵌合抗原受体包括依次串联的胞外区肽段、跨膜区肽段和胞内结构域肽段，所述胞外区肽段包括信号肽、能同时结合BCMA抗原和CD38抗原的胞膜外抗原结合区，所述跨膜区肽段为CD8跨膜区肽段，所述胞内结构域为CD3zeta，共刺激信号结构域为4-1BB。其中，所述胞外区肽段与跨膜区肽段通过铰链区肽段相连。优选的，所述嵌合抗原受体编码的氨基酸序列如SEQNO.11所述。编码所述同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体的基因也在本专利技术的保护范围内。所述基因的核酸序列如SEQNO.12所示。一种含有上述基因的重组表达载体也在本专利技术的保护范围内。一种含有上述基因或者重组表达载体的宿主细胞也在本专利技术保护范围内。本专利技术还公开了上述嵌合抗原受体、核酸分子、载体、宿主细胞用于制备预防或治疗肿瘤的药物的用途。所述肿瘤为多发性骨髓瘤。有益效果：本专利技术以人BCMA、CD38为靶点，同时靶向多发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体，其特征在于，包括能同时结合BCMA抗原和CD38抗原的胞膜外抗原结合区、跨膜区和胞内信号结构域，其中，所述胞膜外抗原结合区包括用于结合BCMA抗原的anti-BCMA scFv和用于结合CD38抗原的anti-CD38 scfv；所述anti-BCMA scfv的重链氨基酸序列如SEQ NO.1所示，轻链序列如SEQ NO.2所示；所述anti-CD38 scfv的重链氨基酸序列如SEQ NO.3所示，轻链序列如SEQ NO.4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体，其特征在于，包括能同时结合BCMA抗原和CD38抗原的胞膜外抗原结合区、跨膜区和胞内信号结构域，其中，所述胞膜外抗原结合区包括用于结合BCMA抗原的anti-BCMAscFv和用于结合CD38抗原的anti-CD38scfv；所述anti-BCMAscfv的重链氨基酸序列如SEQNO.1所示，轻链序列如SEQNO.2所示；所述anti-CD38scfv的重链氨基酸序列如SEQNO.3所示，轻链序列如SEQNO.4所示。


2.根据权利要求1所述的同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的胞膜外抗原结合区结构为VH1-VL1-VH2-VL2、VL1-VH1-VH2-VL2、VH1-VL1-VL2-VH2、VL1-VH1-VL2-VH、VH2-VL2-VH1-VL1、VH2-VL2-VL1-VH1、VL2-VH2-VH1-VL1、VL2-VH2-VL1-VH1中的任一种，其中1为anti-BCMAscfv，2为anti-CD38scfv。


3.根据权利要求1所述的同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞膜外抗原结合区氨基酸序列如SEQNO.5所示。


4.根据权利要求1所述的同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原...

【专利技术属性】
技术研发人员：李俊，郭志刚，
申请(专利权)人：南京蓝盾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32