抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽TAT-KR-12及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种抗浮游菌和胞内菌感染的新型抗菌肽及其应用，通过化学共价接枝的方法将人源抗菌肽LL‑37的生物活性片段KR‑12与细胞穿透肽TAT接合在一起形成一种新型抗菌肽TAT‑KR‑12。新合成的抗菌肽TAT‑KR‑12不仅具有抗浮游菌作用，并且在具有良好的生物相容性的同时具有抗胞内菌的效果，除此之外，还具有抗炎效果。本抗菌肽，制备工艺简单、效率高、可重复性好，在有效抗浮游菌的同时对胞内菌也有良好的效果，还具有一定的抗炎性，弥补了传统抗菌药物的不足，具有非常重要的临床意义。

Antimicrobial peptide tat-kr-12 against phytoplankton and intracellular infection and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽TAT-KR-12及其制备方法与应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽及其制备方法与应用。
技术介绍
金黄色葡萄球菌是骨科感染最常见的细菌(Rumian,L.,etal.,MaterSciEngCMaterBiolAppl,2016.69:p.856-64.；Wright,J.A.andS.P.Nair,IntJMedMicrobiol,2010.300(2-3):p.193-204.)金黄色葡萄球菌可以侵入包括成骨细胞和巨噬细胞在内的宿主细胞，逃避机体的免疫监视和免疫清除作用，并且在宿主细胞内能够存活和繁殖一段时间，从而构成了一个可能导致复发性感染的储库(chwarz-Linek,U.,M.andJ.R.Potts,Mol.Microbiol.,2004.52(3):p.631-41.)。目前临床所应用的大多数抗生素对胞内菌的作用能力有限，使得感染难以被消除，除非延长抗生素的治疗时间，增加剂量或者联合应用抗生素。这就解释了为什么在应用β-内酰胺类抗生素治疗金黄色葡萄球菌感染时，抗菌效力会逐渐降低以及急性感染是如何转变为慢性感染的。虽然大环内酯类抗生素能够穿透细胞，但是抗胞内菌效力不足(Mor,N.,etal.,Antimicrob.AgentsChemother.,1994.38(12):p.2738-42.)传统抗生素治疗金黄色葡萄球菌感染的效率正在降低，因此，需要一种新的抗菌药物，除了抗浮游菌，还应在在不损伤宿主细胞的同时有效的抗胞内菌。抗菌肽在低浓度下对多种微生物(包括在许多情况下对传统抗生素具有耐药性的微生物)有效。传统的抗生素通过靶向细菌生长中的各种生物合成过程(包括蛋白质，RNA，DNA，肽聚糖和叶酸合成等)来杀死或抑制细菌的生长，而抗菌肽通常不针对特定的微生物分子，而是直接与微生物膜相互作用并迅速渗透，换句话说，它们主要通过裂解机制起作用。它们的氨基酸组成决定了其结构性质，如两亲性、阳离子电荷、形状和大小，有利于与微生物表面的相互作用、插入脂质双分子层，进而破坏稳定并损害细菌膜的物理完整性。目前提出了几种不同的模型来描述这种作用方式的后果，包括桶形壁和环形孔的机理，聚集通道的形成以及类似洗涤剂的地毯效应(Brogden,K.A.,NatRevMicrobiol,2005.3(3):p.238-50.)。与传统的抗生素相比，抗菌肽除了具有广谱的抗菌性能，毒性小，还具有其他的生物活性如调节机体的免疫等。其可直接抗菌和通过调节机体防御系统清除细菌，细菌不容易产生耐药性，且抗菌肽可以进入到细胞内发挥免疫调节作用，同时具有复杂及未知的生物活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽及其制备方法与应用，解决传统抗菌药物不能有效抗胞内菌问题。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽TAT-KR-12，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还提供了上述抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽TAT-KR-12的制备方法，其特征在于，所述抗菌肽TAT-KR-12是通过化学共价接枝将人源抗菌肽LL-37的生物活性片段KR-12与细胞穿透肽TAT接合在一起得到。优选地，所述生物活性片段KR-12的序列如SEQIDNO：2所示。优选地，所述细胞穿透肽TAT的序列如SEQIDNO：3所示，该序列负载正电荷，其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用。优选地，所述人源抗菌肽LL-37的序列如SEQIDNO：4所示。优选地，所述的化学共价接枝具体为：将人源抗菌肽LL-37的生物活性片段KR-12与细胞穿透肽TAT通过固相多肽合成法制备，随后用高效液相色谱(HPLC)纯化多肽。本专利技术还提供了上述抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽TAT-KR-12在制备抗浮游菌药物中的应用。本专利技术还提供了上述抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽TAT-KR-12在制备抗细胞内细菌感染药物中的应用。优选地，所述应用中细胞内细菌的类型为金黄色葡萄球菌(ATCC25923)，它能够进入细胞内，并且在具有感染能力的同时存活于细胞内一段时间。本专利技术还提供了上述抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽TAT-KR-12在制备抑制炎症反应药物中的作用。优选地，所述抑制炎症反应为抑制巨噬细胞炎症反应，具体为抑制炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-α)，白介素-1β(IL-1β)，诱导型一氧化氮合酶(INOS)及相关炎症基因的表达。更优选地，所述巨噬细胞为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7，此细胞株源自雄性Abelson鼠科白血病病毒诱导的肿瘤。抗菌肽KR-12序列为KRIVQRIKDFLR，该序列是一种缘于人源抗菌肽LL-37的生物活性片段。该抗菌肽KR-12除具有较广谱的抗菌能力并且对间充质干细胞没有细胞毒性。细胞穿透肽TAT(序列YGRKKRRQRRR,HIV-1TAT蛋白残基47-57)负载正电荷，其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用。目前已经被广泛应用于膜不渗透生物大分子的胞内传递。细菌内化到细胞内是慢性感染及再次感染的主要原因，目前大多抗菌药物对于细胞内的细菌无效,本专利技术将抗菌肽KR-12与穿透TAT通过固相多肽合成法制备的新型抗菌肽TAT-KR-12，在不损害细胞的同时具有抗胞内菌的效果。本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术提供了一种抗浮游菌和胞内菌感染的新型抗菌肽及其应用，通过化学共价接枝的方法将人源抗菌肽LL-37的生物活性片段KR-12与细胞穿透肽TAT接合在一起形成一种新型抗菌肽TAT-KR-12。新合成的抗菌肽TAT-KR-12不仅具有抗浮游菌作用，并且在具有良好的生物相容性的同时具有抗胞内菌的效果，除此之外，这种新型抗菌肽还具有抗炎效果。(3)本专利技术的新型抗菌肽的制备方法为固相多肽合成法，使用不溶性高聚物为载体，通过其活性基团将反应物之一固定在高分子载体上，使有机合成在固相上进行的方法，合成后用高效液相色谱(HPLC)纯化多肽，纯度在95％以上。该方法技术成熟，工艺简单，效率高，成本低，能够合成具有任意单体序列的多肽。(3)本专利技术抗菌肽产品不产生溶血性，生物相容性良好，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及耐药菌株都具有较好的抗菌作用。更重要的是，针对临床上常用的抗菌药物不能有效抗胞内菌的缺点，本专利技术的新型抗菌肽抗胞内菌效果良好，并且还具有抗炎特性。所以，本专利技术产品抗菌肽在治疗临床胞内菌感染中能够得到较佳的应用。附图说明图1：本专利技术的抗菌肽KR-12，TAT和TAT-KR-12的螺旋投影图；图2：本专利技术的抗菌肽KR-12，TAT和TAT-KR-12的溶血活性检测结果；图3：本专利技术的抗菌肽KR-12，TAT和TAT-KR-12的细胞毒性检测结果；图4：本专利技术的抗菌肽KR-12，TAT和TAT-KR-12的细胞质膜去极化结果；图5：本专利技术的抗菌肽TAT-KR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽TAT-KR-12，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽TAT-KR-12，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.权利要求1所述的抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽TAT-KR-12的制备方法，其特征在于，所述抗菌肽TAT-KR-12是通过化学共价接枝将人源抗菌肽LL-37的生物活性片段KR-12与细胞穿透肽TAT接合在一起得到。


3.如权利要求2所述的抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽TAT-KR-12的制备方法，其特征在于，所述生物活性片段KR-12的序列如SEQIDNO：2所示。


4.如权利要求2所述的抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽TAT-KR-12的制备方法，其特征在于，所述细胞穿透肽TAT的序列如SEQIDNO：3所示。


5.如权利要求2所述的抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽TAT-KR-12的制备方法，其特征在于，所述人源抗菌肽LL-37的序列如SEQIDNO：4所示。


6.如权利要求2所述的抗浮游菌和胞内菌感染的抗菌肽TAT-KR-12的制备方法，其特征在于，所述的化学共价接枝具体为：将人源抗菌肽LL-37的生物活性片段KR-12与细胞穿透肽TAT通过固相多肽合成...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳冰，聂彬恩，霍市城，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：上海;31